Charakterisierung des 5-HT_3B-Promotors der Ratte vor dem Hintergrund eines mit Chemotherapie-induziertem Erbrechen assoziierten Polymorphismus

Abstract

5-HT3B ist eine Untereinheit des Serotoninrezeptors Typ 3 (5-HT3), einem Ionenkanal aus der Cys-loop-Rezeptorfamilie. Das Gen HTR3B kodiert für 5-HT3B. Der -100_-102delAAG-Polymorphismus im HTR3B-Promotor kann die HTR3B-Promotoraktivität beeinflussen und wurde mit Häufigkeit und Schweregrad von Chemotherapie-induzierter Übelkeit und Erbrechen unter der Antiemetik-Therapie mit 5-HT3-Rezeptorantagonisten assoziiert. Es ist wenig über die transkriptionelle Regulation des HTR3B-Gens und über den Mechanismus, wie der -100_-102delAAG-Polymorphismus die HTR3B-Expression beeinflusst, bekannt. Der Promotor des Ratten-Htr3B-Gens wurde in der Ratten-Phäochromozytom-Zelllinie PC-12 und in der menschlichen Zelllinie HEK-293 charakterisiert. Dafür wurden RACE-basierte Transkriptionsstartseitenanalysen, in vitro- und in vivo-DNA-Methylierungsanalysen, bioinformatische Analysen, DNase I Hypersensitivity Assays, Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSAs) sowie Luciferase-Reportergenversuche inkl. ortspezifischer Mutationen und Proteinüberexpressionen benutzt. Um im -100_-102delAAG-Bereich bindende Proteine zu identifizieren, wurden EMSAs sowie eine Affinitätsaufreinigung gekoppelt mit einer massenspektrometrischen Analyse benutzt. Das Ratten-Htr3B-Gen hat multiple Transkriptionsstartseiten (TSS), aber keine kanonisch angeordneten Kernpromotorelemente. Eine TSS, bei -109 bp vor dem translationalen Startkodon, ist stark zwischen Mensch und Ratte konserviert. Mutationen im Bereich der -109 bp TSS führten zu einer Abnahme der Htr3B-Promotoraktivität um 68%. Im Htr3B-Promotorbereich wurde eine CpG-Insel identifiziert. Diese stellte sich aber als unbedeutend für die Transkriptionsinitiation heraus. Eine für die transkriptionelle Htr3B-Regulation relevante evolutionär konservierte Region (ECR) wurde ca. 1,5 kb stromaufwärts vom ATG identifiziert. Der proximale Promotor ist in einem Bereich ab -445 bp vor dem Startkodon lokalisiert. Es wurden drei trans-regulatorische Elemente im proximalen Htr3B-Promotor identifiziert; die Transkriptionsfaktoren USF1 (Upstream Stimulatory Factor 1), YY1 (Ying Yang 1) und NF-1 (Nuclear Factor-1). USF1 bindet an einer E-Box zwischen -183 bis -178 bp vor dem Startkodon. Eine Mutation der USF1-Bindungssequenz führte im -258 bp-Promotorfragment zu einer Abnahme der Aktivität um 55%. Die Überexpression von USF1 resultierte in einer signifikanten Zunahme der Promotoraktivität im nativen, aber nicht im E-Box-mutierten Promotor. YY1 bindet bei -284 bis -269 bp und -266 bis -252 bp an den Htr3B-Promotor. NF-1 bindet bei -267 bis -253 bp. Am humanen HTR3B-P1-Promotor, im Bereich um den -100_-102delAAG-Polymorphismus, wurde die Sequenz GGAGAAGGAGGAGAACAGAGTG als essentiell für die Bindung des Proteins identifiziert. Vier potentiell bindende Proteine wurden identifiziert: ZNF207 (Zinc finger protein 207), hnRNP U (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U), SFPQ (Splice factor, proline- and glutamine-rich) und NonO (Non-POU domain-containing octamer-binding protein). Sequenzanalysen und EMSA-Daten bestätigen die Möglichkeit, dass SFPQ und NonO im Bereich des -100_-102delAAG-Polymorphismus binden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Transkription des Ratten-Htr3B-Gens über multiple TSS initiiert und durch USF1, YY1 und NF-1 reguliert wird. Die Htr3B-Transkription ist unabhängig von der DNA-Methylierung. Potentielle Bindungsstellen für YY1 und NF-1 kommen in den menschlichen HTR3B-Promotorbereichen vor, sind aber nicht für die Effekte des -100_-102delAAG-Polymorphismus verantwortlich.