Epidemiologische Untersuchungen zur Toxoplasmose und Identifizierung immunogener parasitärer Antigene
Epidemiological analysis of toxoplasmosis and identification of immunogenic parasitic antigens
by Andrea Hotop née Hruzik
Date of Examination:2011-07-07
Date of issue:2012-02-23
Advisor:Prof. Dr. Uwe Groß
Referee:Prof. Dr. Uwe Groß
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Toxoplasmosis is an infectious disease caused by the parasite Toxoplasma gondii. Whereas the infection proceeds in most cases asymptomatically in immunocompetent humans, a threat for the foetus occurs when a primary infection takes place in pregnancy. An infection of the foetus can lead to an abort or cause serious symptoms in the newborn. A prenatal treatment shall prevent transmission of the parasite from the mother to the fetus or reduce clinical symptoms in the child. To estimate the efficacy of the therapy that is used in Germany, we performed a retrospective analysis with 685 pregnant women, who showed serological evidence for a primary infection. As a result we could show that antiparasitic therapy that is initiated within four weeks after infection decrease the risk for clinical symptoms in the child.For the performance of valid epidemiological investigations, reliable diagnostic markers are indispensable. For this purpose it is important to know that T. gondii is an intracellular parasite which exists in three different stages: as oocysts, tachy- and bradyzoites. Within an acute infection replicating tachyzoites dominate, while bradyzoites-containing cysts are presenting in the chronic phase of infection. Each parasite stage is known to express stage-specific antigens.Hence, one aim of this study was to identify diagnostic markers which allow the differentiation between an acute and chronic infection. By using 2D gelelectrophoresis and mass spectrometry, the proteins GRA1, GRA7, ROP9, MIC5 and SUB1 were identified as markers for an acute infection. These as well as seven other proteins were recombinantly expressed in E. coli and evaluated for their diagnostic qualities in a lineblot assay with human serum samples. By detection of specific IgG antibodies against rGRA1, rGRA2 and rGRA6, a Toxoplasma infection could be recognized in up to 100 %. However, a discrimination of the infection stage was impossible. Instead, an acute infection could be distinguished from a chronic infection with a likelihood of up to 92 % by detection of rSUB1 and rGRA6 specific IgG and IgA antibodies.Furthermore, we also examined with the lineblot technique whether the recombinant antigens might have the potential to identify one of the most prevalent clinical manifestations, ocular toxoplasmosis (retinochorioiditis). Thereby, significant differences were observed by the detection of GRA2-specific IgA- and BAG1-specific IgG antibodies between patients with retinochorioiditis and T. gondii-infected patients without ocular lesions.Whether to determine the lineblot using the recombinant antigens might also be of value for application in veterinary medicine, we analyzed serum samples of oocysts- or tachyzoites-infected chickens, turkeys and pigs. Thereby, we could show that the animals seem to exhibit antibody kinetics that depend on the infection-dose and the parasite stage that was used for infection.In conclusion, the results achieved by this study could be contributed as an advance for the diagnostic and therapy of the toxoplasmosis, especially in pregnancy.
Keywords: Toxoplasma gondii; diagnostic; recombinant antigens
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Die Toxoplasmose ist eine Infektionskrankheit, die durch den Parasiten Toxoplasma gondii verursacht wird. Während eine Infektion bei den meisten immunkompetenten Menschen asymptomatisch abläuft, kann bei einer Primärinfektion in der Schwangerschaft der Parasit auf den Föten übergehen und zu einem Abort oder zu schweren Erkrankungen dessen führen.Eine pränatale Therapie soll eine Übertragung verhindern oder klinische Auswirkungen beim Kind mindern. Um die Effektivität der in Deutschland durchgeführten Therapie beurteilen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine retrospektive Untersuchung von 685 schwangeren Frauen durchgeführt, deren serologische Befunde auf eine Primärinfektion hindeuteten. In Folge dieser Studie konnte gezeigt werden, dass eine innerhalb von vier Wochen nach Infektion eingeleitete antiparasitäre Therapie das Risiko für die Ausprägung von klinisch-manifesten Erkrankungen des Kindes mindert.Um valide epidemiologische Untersuchungen durchführen zu können ist eine zuverlässige Diagnostik unabdingbar. Hierfür ist von Bedeutung, dass T. gondii ein intrazellulärer Parasit ist, welcher in drei verschiedenen Stadien vorkommt: als Oozysten, Tachy- und Bradyzoiten. Bei einer akuten Infektion sind vorwiegend sich schnell vermehrende Tachyzoiten vorhanden, während bei einer chronischen Infektion Bradyzoiten-enthaltene Zysten dominieren. Es wird davon ausgegangen, dass jedes Parasitenstadium spezifische Antigene exprimiert.Im Zuge dieser Arbeit sollten daher diagnostische Marker identifiziert werden, die eine Differenzierung zwischen einer akuten und einer chronischen Infektion erlauben. Über 2D-Gelelektrophoresen und Massenspektrometrie konnten dabei u. a. die Proteine GRA1, GRA7, ROP9, MIC5 und SUB1 als Marker für eine akute Infektion ermittelt werden. Diese, sowie sieben weitere Proteine, wurden rekombinant in E. coli hergestellt und in einem Lineblot-Verfahren an Humanseren auf ihre diagnostischen Eigenschaften untersucht.Durch den Nachweis spezifischer IgG-Antikörper gegen rGRA1, rGRA2 und rGRA6 konnte eine Toxoplasma-Infektion in bis zu 100 % erkannt werden. Eine Diskriminierung des Infektionsstadiums war allerdings nicht möglich. Eine akute Infektion ließ sich jedoch durch den Nachweis von rSUB1- und rGRA6-spezifischen IgG- und IgA Antikörper mit einer Wahrscheinlichkeit von bis zu 92 % von einer chronischen Infektion unterscheiden.Des Weiteren wurden mit Hilfe des Lineblot-Verfahrens untersucht, ob die rekombinanten Antigene auch Potenzial hatten eine der häufigsten klinisch-manifesten Erkrankungen - die okuläre Toxoplasmose (Retinochorioiditis) - zu identifizieren. Dabei konnten durch den Nachweis GRA2-spezifischer IgA- und BAG1-spezifischer IgG-Antikörper signifikante Unterschiede bei Patienten mit einer Retinochorioiditis im Vergleich zu T. gondii infizierten Patienten ohne okuläre Läsionen festgestellt werden.Um festzustellen, ob der Lineblot-Assay unter der Verwendung rekombinanter Antigene auch in der Veterinärmedizin eingesetzt werden kann, wurden Verlaufseren von Hühnern, Puten und Schweinen untersucht, die experimentell mit Oozysten oder Tachyzoiten infiziert worden waren. Dabei zeigten die Tiere, in Abhängigkeit von dem getesteten Antigen, eine teilweise Infektionsdosis- und Infektionsart-abhängige Antikörper-Kinetik.In der Zusammenschau können die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zur Verbesserung der Diagnostik und Therapie der Toxoplasmose insbesondere in der Schwangerschaft beitragen.
Schlagwörter: Toxoplasma gondii; Diagnostik; rekombinante Antigene