Synaptic vesicle recycling <i>in Vivo</i>

Abstract

Die Grundlagen der Reizweiterleitung an Synapsen sind prinzipiell gut verstanden: Wenn ein Aktionspotenzial die Synapse erreicht, induziert es einen Kalziumeinstrom, der wiederum zur Fusion synaptischer Vesikel mit der Plasmamembran führt, woraufhin die in den Vesikeln enthaltenen Neurotransmitter in den synaptischen Spalt entlassen werden. Die Neurotransmitter diffundieren zur postsynaptischen Zelle, wo sie an die entsprechenden Rezeptoren binden und eine Veränderung des Membranpotentials bewirken. An der Präsynapse wird die Vesikelmembran wieder in die Zelle aufgenommen und wiederum mit Neurotransmitter gefüllt, was als Vesikelrecycling bezeichnet wird. Überraschenderweise können Synapsen bis zu einer halben Millionen Vesikel enthalten, von denen die meisten in vielen Präparationen in vitro durch Hochfrequenz-Stimulierung zum Recycling angeregt werden können. Es ist jedoch nicht bekannt, inwieweit diese Vesikel an der Reizweiterleitung in vivo beteiligt sind. Das Ziel dieses Projekts war es daher, die Anzahl der Vesikel zu bestimmen, die ein lebendes Tier in einem definierten Zeitraum verwendet. Der Vesikelverbrauch in vivo wurde mit drei unterschiedlichen Ansätzen untersucht: Zunächst wurde der Fluoreszenzfarbstoff FM 1-43 in ein lebendes Tier injiziert, welches sich daraufhin für einen definierten Zeitraum frei bewegen konnte; während dieser Zeit wurde der Farbstoff in die recycelten Vesikel aufgenommen. Danach wurde das zu untersuchende Organ entnommen und photooxidiert, was die Identifizierung und Quantifizierung der markierten Vesikel mithilfe der Elektronenmikroskopie ermöglicht. Mit dieser Methode konnte ich zeigen, dass über einen Zeitraum von mehreren Stunden nur 1-5% aller Vesikel an der Reizweiterleitung beteiligt waren. Dies galt für verschiedenste Modellorganismen, darunter Nematoden, Insekten, Fische, Amphibien, Vögel und Säugetiere. Dieser geringe Vesikelverbrauch wurde durch zwei unabhängige Ansätze bestätigt, wobei es sich einerseits um die Untersuchung von pHluorin Drosophila Larven in Kombination mit einer Injektion des Protonenpumpen-Inhibitors Bafilomycin und andererseits um die elektronenmikroskopische Untersuchung der Drosophila Mutante shibire handelte, welche ein temperaturabhängiges Endocytose-Defizit aufweist. Um den molekularen Mechanismus zu bestimmen, der die Mehrheit der Vesikel am Recycling hindert, verwendeten wir einen Drosophila Knockout Stamm des Vesikel-assoziierten Proteins Synapsin. Tatsächlich konnten wir zeigen, dass Synapsin die Mobilität der nicht-aktiven Vesikelpopulation einschränkt. Außerdem führte der Knockout von Synapsin zu einem signifikanten Anstieg des Anteils aktiver Vesikel in vivo. Synapsin ist also eines der Moleküle, welches aktive und nicht-aktive Vesikel voneinander unterscheidet. Schließlich wurde die Funktion der nicht-aktiven Vesikelpopulation untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass diese Vesikel als molekularer Puffer dienen könnten, indem sie am Recycling beteiligte Proteine in der Synapse zurück halten. Durch Antikörperfärbung und STED (stimulated emission depletion) Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass Vesikelcluster (die hauptsächlich nicht-aktive Vesikel enthalten) die entsprechenden Proteine anreichern, was auch durch Immunoblotting bestätigt werden konnte. In Einklang mit dem Puffermodell führte die Zerstörung der Vesikelcluster durch das Gift der Schwarzen Witwe (Black Widow Spider Venom; BWSV) zur Diffusion dieser Proteine aus der Synapse in das Axon. In weiteren Experimenten konnten wir mithilfe des Kalzium-Ionophors Ionomycin zeigen, dass der molekulare Puffer vermutlich durch Kalzium kontrolliert wird (dies wurde auch biochemisch bestätigt). Dieser Regulationsmechanismus könnte erklären, wie die Vesikelcluster die löslichen Proteine bei Bedarf an die aktiven Vesikel weitergeben können. Zusammenfassend zeigt dieses Projekt, dass der Großteil der synaptischen Vesikel nicht direkt an der Reizweiterleitung in vivo beteiligt ist. Stattdessen unterstützen sie die Signalübertragung indirekt durch Bereitstellung bestimmter Proteine für das Recycling der wenigen aktiven Vesikel.