Crystallographic studies on a cold adapted subtilase and proteins involved in mRNA processing
Kristallographische Studien an einer kälteadaptiven Subtilase und an mRNA-Prozessierung beteiligten Proteinen
by Jóhanna Arnórsdóttir
Date of Examination:2005-04-28
Date of issue:2005-06-03
Advisor:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:Prof. Dr. Oliver Einsle
Referee:Prof. Dr. Peter Susse
Referee:PD Dr. Stefan Irniger
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Size:4.62Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The crystal structure of a subtilisin-like serine proteinase from the psychrotrophic marine bacterium, Vibrio sp. PA-44, was solved by means of molecular replacement and refined at 1.84 Å resolution. This is the first structure of a cold adapted subtilase to be determined and its elucidation facilitates examination of the molecular principles underlying temperature adaptation of enzymes. The cold adapted Vibrio-proteinase was compared to known three-dimensional structures of homologous enzymes of meso- and thermophilic origin, proteinase K and thermitase, to which it has high structural resemblance. The main structural features standing out as plausible determinants of the different temperature adaptation of the enzymes involve the character of their exposed and buried surface areas. The hydrophobic effect is found to play a significant role for the structural stability of the meso- and thermophile enzymes, whereas the cold enzyme exposes more of its apolar surface. In addition, the cold adapted Vibrio-proteinase is distinguished from the more stable enzymes by its strong anionic character arising from the high occurrence of uncompensated negatively charged residues on its surface. Interestingly, both the cold and thermophile proteinases differ from the mesophile enzyme in having more extensive hydrogen- and ion pair interactions in their structures, supporting suggestions of the dual role of electrostatic interactions in adaptation of enzymes to both high and low temperatures. The Vibrio-proteinase has three calcium ions associated with its structure, one of which is in a calcium-binding site not described in other subtilases.A 61 kDa protein component of the human spliceosome is indispensable for the assembly of the [U4/U6·U5] triple snRNP. The gene encoding the 61 kDa spliceosomal protein was overexpressed in E. coli and purified for crystallisation trials. No crystals were obtained. Evidence of incomplete folding and heterogeneity due to unspecific binding of E. coli nucleic acids emerged in the purification process.A 42 kDa protein component of the Trypanosoma brucei RNA editosome has endo- and exonuclease activity and is suggested to mediate protein-protein and/or protein-RNA interactions. Attempts were made to crystallise the 42 kDa protein with and without non-hydrolysable double stranded nucleic acid ligands but without success.
Keywords: cold adaptation; crystal structure; psychrotrophic; subtilase; thermostability; spliceosome; RNA-editing
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Die Kristallstruktur einer Subtilisin-ähnlichen Serin-Proteinase des psychrotrophen marinen Bakteriums, Vibrio sp. PA-44, wurde durch molekularen Ersatz bei 1,84 Å Auflösung aufgeklärt. Damit konnte zum ersten Mal die Struktur einer kälteadaptiven Subtilase aufgeklärt werden. Dies macht es möglich, die molekularen Prinzipien, die der Temperaturadaption von Enzymen zu Grunde liegen, genauer zu untersuchen. Die kälteadaptive Vibrio-Proteinase wurde mit bekannten dreidimensionalen Strukturen von homologen Enzymen meso- und thermophilen Ursprungs, Proteinase K und Thermitase, verglichen, zu denen eine hohe strukturelle Ähnlichkeit besteht. Zu den strukturellen Hauptmerkmalen, die als mögliche Determinanten der unterschiedlichen Temperaturadaption der verglichenen Enzyme in Frage kommen, gehört der Charakter ihrer exponierten und verborgenen Oberfläche. So scheint der hydrophobe Effekt wichtig zu sein für die strukturelle Stabilität der meso- und thermophilen Enzyme, während die kälteadaptiven Enzyme einen größeren Teil ihrer apolaren Oberfläche exponieren. Hinzu kommt, dass sich die kälteadaptive Vibrio-Proteinase von den stabileren Enzymen durch einen stark anionischen Charakter unterscheidet, der durch das hohe Auftreten von negativ geladenen Resten auf ihrer Oberfläche hervorgerufen wird. Interessanterweise unterscheiden sich die kälteadaptive sowie die thermophile Proteinase von dem mesophilen Enzym durch ausgeprägtere Wasserstoff- und Ioneninteraktionen in ihrer Struktur, was auf eine duale Rolle der elektrostatischen Interaktionen in der Adaption von Enzymen zu hohen sowie tiefen Temperaturen andeutet. Die Vibrio-Proteinase hat drei Kalziumione an ihrer Oberfläche gebunden, davon eine an einer Kalzium bindenden Stelle, die bei anderen Subtilasen nicht bekannt ist.Ein 61 kDa Protein des humanen Spleissosoms ist unverzichtbar für den Aufbau des [U4/U6ּU5] tri-snRNPs. Das 61 kDa Protein wurde in E. coli hergestellt und für Kristallisationsansätze gereinigt. Kristalle von dem 61 kDa Protein konnten nicht gewonnen werden.Ein 42 kDa Protein des Trypanosoma brucei RNA Editosoms hat Endo- und Exonuklease Aktivität und soll Protein-Protein und/oder Protein-RNA Interaktionen vermitteln. Versuche, dieses 42 kDa Protein zu kristallisieren, waren sowohl mit als auch ohne Nukleinsäureliganden nicht erfolgreich.
Schlagwörter: Kälteadaption; Kristallstruktur; psychrotropisch; Subtilase; Thermostabilität; Spleißosom; RNA-Editierung