Crystallographic studies on a cold adapted subtilase and proteins involved in mRNA processing

Abstract

Die Kristallstruktur einer Subtilisin-ähnlichen Serin-Proteinase des psychrotrophen marinen Bakteriums, Vibrio sp. PA-44, wurde durch molekularen Ersatz bei 1,84 Å Auflösung aufgeklärt. Damit konnte zum ersten Mal die Struktur einer kälteadaptiven Subtilase aufgeklärt werden. Dies macht es möglich, die molekularen Prinzipien, die der Temperaturadaption von Enzymen zu Grunde liegen, genauer zu untersuchen. Die kälteadaptive Vibrio-Proteinase wurde mit bekannten dreidimensionalen Strukturen von homologen Enzymen meso- und thermophilen Ursprungs, Proteinase K und Thermitase, verglichen, zu denen eine hohe strukturelle Ähnlichkeit besteht. Zu den strukturellen Hauptmerkmalen, die als mögliche Determinanten der unterschiedlichen Temperaturadaption der verglichenen Enzyme in Frage kommen, gehört der Charakter ihrer exponierten und verborgenen Oberfläche. So scheint der hydrophobe Effekt wichtig zu sein für die strukturelle Stabilität der meso- und thermophilen Enzyme, während die kälteadaptiven Enzyme einen größeren Teil ihrer apolaren Oberfläche exponieren. Hinzu kommt, dass sich die kälteadaptive Vibrio-Proteinase von den stabileren Enzymen durch einen stark anionischen Charakter unterscheidet, der durch das hohe Auftreten von negativ geladenen Resten auf ihrer Oberfläche hervorgerufen wird. Interessanterweise unterscheiden sich die kälteadaptive sowie die thermophile Proteinase von dem mesophilen Enzym durch ausgeprägtere Wasserstoff- und Ioneninteraktionen in ihrer Struktur, was auf eine duale Rolle der elektrostatischen Interaktionen in der Adaption von Enzymen zu hohen sowie tiefen Temperaturen andeutet. Die Vibrio-Proteinase hat drei Kalziumione an ihrer Oberfläche gebunden, davon eine an einer Kalzium bindenden Stelle, die bei anderen Subtilasen nicht bekannt ist.Ein 61 kDa Protein des humanen Spleissosoms ist unverzichtbar für den Aufbau des [U4/U6ּU5] tri-snRNPs. Das 61 kDa Protein wurde in E. coli hergestellt und für Kristallisationsansätze gereinigt. Kristalle von dem 61 kDa Protein konnten nicht gewonnen werden.Ein 42 kDa Protein des Trypanosoma brucei RNA Editosoms hat Endo- und Exonuklease Aktivität und soll Protein-Protein und/oder Protein-RNA Interaktionen vermitteln. Versuche, dieses 42 kDa Protein zu kristallisieren, waren sowohl mit als auch ohne Nukleinsäureliganden nicht erfolgreich.