Molecular mechanisms of the cytokine-dependent induction of the heme oxygenase-1 gene: in vivo and in vitro studies
Molekulare Mechanismen der Zytokin-abhängigen Induktion des Hämoxygenase-1 Gens: in vivo und in vitro Studien
von Kyrylo Tron
Datum der mündl. Prüfung:2004-06-30
Erschienen:2004-09-27
Betreuer:Prof. Dr. Dr. h.c. Giuliano Ramadori
Gutachter:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
Gutachter:Prof. Dr. Dr. h.c. Kurt von Figura
Gutachter:Prof. Dr. Gerhard Burckhardt
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Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Heme oxygenase 1 (HO-1) is the inducible enzyme which catalyzes the rate-limiting reaction of heme degradation yielding carbon monoxide (CO), divalent iron (Fe2+), and biliverdin. Due to a broad range of anti-inflammatory activities of these products, HO-1 has been proposed to be involved in the acute phase response (APR), the defense reaction of the organism directed against any damaging or injuring agents. However, the mechanisms of the HO-1 regulation under inflammatory conditions are poorly understood. Therefore, the purpose of the present study was to examine the HO-1 expression during the APR and to evaluate the role of interleukin-6 (IL-6), the principle mediator of inflammation, in this process using in vivo and in vitro approaches.The present study has demonstrated that during turpentine oil (TO)-induced localized inflammation in rats, the expression of HO-1 was strongly up-regulated at early time points in injured muscle and in the liver. In other internal organs investigated, only moderate changes were observed. As revealed by immunohistochemical analysis, in injured muscle the induction of HO-1 was attributed to macrophages, whereas in the liver, hepatocytes were the major source of the elevated HO-1 levels during the APR. Among various tissues examined under inflammatory conditions by Northern blot, muscular tissue at the site of TO injection was found to be the only source of IL-6. The up-regulation of IL-6 mRNA levels was followed by elevated plasma levels of this cytokine, as measured by the rat IL-6-specific ELISA. The elevated plasma IL-6 concentrations correlated with hepatic HO 1 induction in the course of inflammation, suggesting that IL-6 derived from injured muscle is most likely responsible for the HO-1 induction in the rat liver. Studies in primary rat hepatocytes further underlined the pivotal role of IL-6 in hepatic HO-1 induction under inflammatory conditions. As demonstrated by Western and Northern blot analyses, among the proinflammatory cytokines (IL-6, IL 1β, and TNF α) used for the treatment of primary cultured rat hepatocytes, IL-6 was the most potent inducer of HO-1 expression in time- and dose-dependent experiments. Sequence analysis of the rat HO-1 promoter revealed the presence of several putative binding sites for transcription factors of the STAT-family, the major transducers of IL-6 signalling. Furthermore, the functional analysis of the rat HO-1 promoter by means of the luciferase reporter gene assay, using deletion and mutation approaches, identified one of the putative STAT binding sites, S3BE, as an active element of the IL-6-dependent HO-1 gene regulation, which does not require cooperation with AP-1 binding site for its action.Taken together, these data suggest that in the liver, HO-1 might be referred to as an intracellular positive acute phase protein which is regulated distantly by plasma IL-6 produced at the site of inflammation.
Keywords: Acute phase response; hepatocytes; HO-1; IL-6; liver; muscle; STAT; turpentine oil
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Hämoxygenase-1 (HO-1) ist das Schlüsselenzym, das den Abbau von Häm zu Carbonmonixid (CO), zweiwertigem Eisen (Fe2+) und Biliverdin katalysiert. Wegen der facettenreichen anti-entzündlichen Wirkweisen dieser Produkte, wurde vorgeschlagen daß HO-1 in der Akuten-Phase Reaktion, der Abwehrreaktion des Organismus gegen schädigende oder verletzende Agentien, eine Rolle spielt. Die Mechanismen der Regulation von HO-1 unter entzündlichen Bedingungen sind jedoch nicht ausreichend verstanden. Daher war das Ziel dieser Arbeit, die HO-1 Expression während der Akuten-Phase Reaktion zu untersuchen, und die Rolle von Interleukin-6 (IL-6), einem wichtigen Mediator von Entzündungsreaktionen, in diesem Prozess durch in vivo und in vitro Experimenten einzuordnen.Unsere Studie hat im Modell einer durch Terpentinöl (TO) induzierten lokalen Entzündungsreaktion in Ratten gezeigt, daß die Expression von HO-1 in Muskel und Leber deutlich erhöht war. In den anderen untersuchten inneren Organen zeigten sich nur mäßige Veränderungen. Wie sich immunhistochemisch zeigte, kann die Induktion von HO-1 im verletzten Muskel Makrophagen zugeschrieben werden, während die Hepatozyten in der Leber die Hauptquelle für HO-1 darstellten. Unter den verschiedenen Geweben, die nach Induktion der Entzündungsreaktion untersucht wurden, konnte das Muskelgewebe am Ort der TO-Injektion als einzige Quelle für IL-6 identifiziert werden. Der erhöhten Expression von IL-6 mRNA folgten erhöhte Werte von IL-6 im Plasma, was durch Ratten-IL-6 spezifischen ELISA bestimmt werden konnte. Die erhöhten Werte für IL-6 im Plasma korrelierten im Verlauf der Entzündung mit der Induktion hepatischer HO-1. Es lässt sich daher vermuten, daß IL-6 aus dem Muskel möglicherweise HO-1 in der Leber der Ratten induziert. Untersuchungen an primären Hepatozyten von Ratten in Kultur unterstreichen weiter die hervorstechende Rolle von IL-6 bei der Induktion hepatischer HO-1 in Entzündungsreaktionen. In Western- und Northern-Blot Analysen zeigte sich, daß unter den proinflammatorischen Zytokinen (IL-6, IL-1β und TNF-α) IL-6 am wirksamsten die Expression von HO-1 induzierte. Die Sequenzanalyse des HO-1 Promotors der Ratte zeigte das Vorhandensein mehrerer mutmaßlicher Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren der STAT-Familie, den Hauptvermittlern des IL-6 Signalwegs. Außerdem konnten funktionale Untersuchungen des HO-1 Promotors der Ratte mittels Luziferase Reportergen Assay durch Deletions- und Mutationsanalysen eine mögliche STAT Bindungsstelle (S3BE), als ein aktives Element der IL-6 abhängigen HO-1 Genregulation identifizieren.Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, daß HO-1 in der Leber ein positives intrazelluläres Akute-Phase Protein darstellt und von IL-6 aus dem Plasma, das an einer entfernt gelegenen Entzündungsstelle entsteht, reguliert wird.
Schlagwörter: Akute-Phase Reaktion; Hepatozyten; HO-1; IL-6; Leber; Muskel; STAT; Terpentinöl