Investigation of Interactions between Homeodomain Proteins and DNA

Abstract

In dieser Arbeit wurden spektroskopische und reaktionskinetische Methoden angewandt, um die Wechselwirkungen zwischen Homeodomän-Proteinen und DNA zu studieren. Die Untersuchung der intrinsischen Fluoreszenz und des Circulardichroismus von Bicoid- (Bcd), Ultrabithorax- (Ubx) und Engrailed- (En) Homeodomänen hat gezeigt, dass die Bindung dieser Proteine an doppelsträngige 15 bp Oligonukleotide Veränderungen in der Sruktur der Homeodomänen hervorruft. Diese Veränderungen sind unterschiedlich für Wechselwirkung mit spezifischen und unspezifischen DNA-Sequenzen. Auch für die DNA-Moleküle wurden erhebliche Konformationsänderungen während der Bindung von Bcd und Ubx an die 15 bp Oligonukleotide, die die jeweiligen spezifischen Erkennungssequenzen enthielten, mittels Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) festgestellt. Die Detektion von FRET hat sich als die empfindlichste Methode zur Beobachtung der Homeodomänen-DNA-Bindung sowohl in stationären als auch in kinetischen Messungen erwiesen. Die mit dieser Methode erhaltenen Fluoreszenztitrationsdaten weisen darauf hin, dass die Bcd- und Ubx-Homeodomänen mit 2:1-Stöchiometrie an die spezifischen Oligonukleotide binden. In beiden Fällen beginnen die Homedomänen-DNA-Komplexe zu aggregieren, wenn die Konzentration des Proteins in der Lösung dieses stöchiometrische Verhältnis überschreitet. Die kinetischen Daten der Bindung der Bcd- und Ubx-Homeodomänen an DNA sind im Einklang mit einem zweistufigen Reaktionsmechanismus. Im ersten Schritt bildet sich ein spezifischer Komplex aus einem Proteinmolekül und dem Oligonukleotid. Im weiteren Reaktionsverlauf bindet ein zweites Proteinmolekül an den spezifischen Komplex, indem es gleichzeitig mit dem zuerst gebundenen Proteinmolekül und der DNA wechselwirkt. Die Bindungsaffinitäten in diesen zwei Phasen unterscheiden sich stark für die Bcd- und die Ubx-Homeodomäne. Die Analyse der Assoziationskinetiken hat gezeigt, dass die Bindung der Bcd- und Ubx-Homeodomänen an DNA ein diffusionskontrollierter Prozess ist. Außerdem wurde festgestellt, dass das starke elektrostatische Feld der alfa-Helix III der Bcd-Homeodomäne eine wichtige Rolle für die richtige Orientierung des Proteins relativ zur DNA spielen kann, so dass die Effizienz der Komplexbildung deutlich erhöht wird.