Entwicklung eines HTS-geeigneten Enzymtests für Histondeacetylasen zur Entwicklung von HDAC-Inhibitoren
Development of an enzyme assay for histone deacetylases suited for HTS for the development of HDAC inhibitors
by Dennis Wegener
Date of Examination:2004-01-21
Date of issue:2004-09-27
Advisor:PD Dr. Andreas Schwienhorst
Referee:PD Dr. Andreas Schwienhorst
Referee:PD Dr. Wilfried Kramer
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
During the past years the pivotal role of histone deacetylases (HDACs) in tumourgenesis was discovered. These enzymes then were quickly ranked as molecular targets by the pharmaceutical industry and the development of specific and highly potential inhibitors became an important goal. An approach often used for the discovery of new lead structures is the screening of large sets of compounds for inhibitors. Therefore strong research activity has been focused on the automation and optimisation of the screening of libraries with high troughput (high-throughput screening, HTS). The most demanding prerequisite for this kind of strategy for the development of inhibitors as well as for basic biochemical characterisation of the enzyme family was an adequate, non-isotopic, biochemical assay for HDAC. In this work the first homogenous, fluorescence-based HDAC-assay was developed which can be employed for HTS. It functions in a two-step process based on a coupled enzyme system and acetylated peptidic substrates. A validation of the assay for its applicability in HTS has been carried out with HDAC from rat liver and human HDAC8, respectively, and well known inhibitors of HDACs. Further evidence for the feasibility of the assay came from the successful identification of inhibitors from a small chemical library. The HDAC-assay was then optimized by the development of a new fluorogenic substrate, Tos-GPK(Ac)-AMC, and reached a Z′-factor of 0,8 (96 well) and 0,47 (1536 well), respectively. Furthermore, inhibiton experiments in vitro identified new HDAC inhibitors (HDACI) with IC50-values for HDAC from rat liver, human HDAC8 and FB188-HDAH in the nanomolar range. A continuous mode of the assay was applied for FB188-HDAH. Moreover, selective HDACI have been developed, which preferentially inhibit a model enzyme of class II HDACs (factor 14-29), or even differentiate between two class I enzymes (factor 58). Selective inhibitors are of great importance for both cancer therapy and the clarification the cellular function of particular HDACs. Substrate specificity has been examined focussing on the volume and the charge of the moiety coupled to the lysine residue of the substrates. With Boc-Lys(Prop)-AMC a substrate was identified that discriminates between HDAC of rat liver, HDAC8 and FB188-HDAH, respectively. The development of Boc-Lys(TFA)-AMC as a new substrate for HDAC8 opened up the possibility to screen for new inhibitors of this enzyme. On the contrary to HDAC1, HDAC8 could be expressed in an active form in E. coli and was isolated from the lysate in sufficient amount and purity by chromatography.
Keywords: Screening; HTS; HDAC; histone deacetylase; inhibitor; assay
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In den letzten Jahren wurde die entscheidende Rolle der Histondeacetylasen (HDAC) bei der Pathogenese von bestimmten Tumoren erkannt und diese folgerichtig als wichtiges molekulares Zielenzym eingestuft. Die Entwicklung von selektiven und hoch potenten Inhibitoren für diese Enzyme wurde damit zum erklärten Ziel der Pharmaforschung. Eine oft verfolgte Strategie zur Entwicklung von neuen Leitstrukturen stellt die Durchmusterung großer chemischer Bibliotheken nach Substanzen dar, die das Zielenzym hemmen (Screening). In den letzten Jahren sind daher verstärkt Bemühungen unternommen worden, die Durchmusterung von Bibliotheken mit hohem Durchsatz (high-throughput screening, HTS) zu automatisieren und zu optimieren. Der Mangel an einem für diese Strategie geeigneten, nicht-radioaktiven, biochemischen Assay stellte bislang ein großes Hindernis in der Entwicklung von HDAC-Inhibitoren (HDACI), wie auch insgesamt bei der biochemischen Charakterisierung dieser Enzymfamilie dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der erste HTS-geeignete, homogene, Fluoreszenz-basierte HDAC-Assay entwickelt, welcher in einem zweistufigem Prozess ein gekoppeltes Enzymsystem und acetylierte peptidische Substrate ausnutzt. Eine Validierung des Assays mit HDAC aus Rattenleber bzw. humaner HDAC8 und Standardinhibitoren sowie die Auffindung von Hemmern in einer kleinen Substanzbibliothek belegte dessen Eignung für HTS-Anwendungen. Der HDAC-Assay konnte im folgenden, vor allem durch die Entwicklung des neuen fluorogenen Substrates Tos-GPK(Ac)-AMC, weiter optimiert werden und erreichte einen Z′-Faktor von 0,8 (96 well) bzw. von 0,47 (1536 well). Darüberhinaus konnten durch in vitro Inhibitionsexperimente auch neue HDACI mit IC50-Werten für HDAC aus der Rattenleber, humane HDAC8 und FB188-HDAH im nanomolaren Bereich identifiziert werden. Für FB188-HDAH kam eine in diesem Fall anwendbare, kontinuierliche Variante des HDAC-Assay zum Einsatz. Darüber hinaus konnten selektive HDACI entwickelt werden, welche entweder präferenziell ein Modellenzym für HDA C der Klasse II hemmen (Faktor 14-29) oder sogar innerhalb der Klasse I-Enzyme differenzieren (Faktor 58). Selektive Inhibitoren sind von großer Bedeutung für die Krebstherapie sowie für die Aufklärung der zellulären Funktion einzelner HDAC. Die Substratspezifität der HDAC wurde im Hinblick auf das Volumen und die Rolle der Ladung der am Lysin der Substrate gekoppelten Reste untersucht. Dabei wurde mit Boc-Lys(Prop)-AMC ein Substrat gefunden, welches zwischen HDAC aus der Rattenleber und HDAC8 bzw. FB188-HDAH diskriminiert. Mit der Entwicklung von Boc-Lys(TFA)-AMC als neuem Substrat für HDAC8 wurde die Möglichkeit erschlossen, Inhibitoren auch für dieses Enzym mittels HTS zu gewinnen. Im Gegensatz zu humaner HDAC1 ließ sich HDAC8 in aktiver Form in E. coli exprimieren und konnte in hinreichender Reinheit und Menge aufgereinigt werden.
Schlagwörter: Hochdurchsatz; HTS; HDAC; Histondeacetylase; Inhibitor; Enzymtest