Adenovirus-mediated gene transfer of FK506-binding proteins FKBP12.6 and FKBP12 in failing and non-failing rabbit ventricular myocytes
Adenoviraler Gentransfer von FK506-bindenden Proteinen in insuffizienten und normalen Kaninchen ventrikulärer Myozyten
by Darya Zibrova
Date of Examination:2004-06-25
Date of issue:2004-09-27
Advisor:Prof. Dr. Gerd Hasenfuß
Referee:Prof. Dr. Dr. h.c. Kurt von Figura
Referee:Prof. Dr. Dieter Heineke
Referee:Prof. Dr. Gerhard Burckhardt
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The FK506-binding proteins (FKBPs) FKBP12 and FKBP12.6 influence the Ca2+-release from the sarcoplasmic reticulum (SR) in skeletal and heart muscle, respectively, via regulation of the SR Ca2+-release channel also known as a ryanodine receptor (RyR). According to the current concept, FKBP12.6 is bound to the cardiac RyR (RyR2), whereas FKBP12 is associated with skeletal muscle RyR isoform (RyR1) solely and, consequently, plays a role in RyR regulation only in skeletal muscle. However, considerably higher expression levels of FKBP12 compared to FKBP12.6 in the heart of several species raise doubts as for exclusive role of FKBP12.6 isoform in the regulation of RyR2. Therefore, the purpose of the present study was to investigate whether FKBP12 contributes to the regulation of Ca2+-cycling in the heart and to examine a potential interaction of FKBP12 with RyR2.In heart failure, Ca2+-release from the SR is disturbed. Defective regulation of RyR2 by FKBP12.6 is thought to be involved in the pathogenesis of heart failure. Therefore, the second intention behind the present study was to characterize heart failure in a rabbit model with respect to FKBP12.6−RyR2 interaction and to investigate whether FKBP12.6 may represent new molecular target to improve contractile function of failing cardiomyocytes.Direct interaction of FKBP12 with cardiac RyR2 isoform was revealed by GST fusion protein pulldown assay. Human recombinant GST-FKBP12 demonstrated specific interaction with rabbit and human RyR2 with a high affinity and in a FK506-displaceable manner similar to those observed with GST-FKBP12.6. To investigate the physiological consequence of this newly described interaction, FKBP12 was overexpressed in isolated rabbit ventricular cardiomyocytes using adenoviral gene transfer. Overexpression of the transgene was verified at mRNA and protein levels using RT-PCR and immunoblotting, respectively. Contractility of isolated rabbit cardiomyocytes was measured by video-edge detection 48 hours after transfection. Cardiomyocytes overexpressing FKBP12 showed a significant increase in fractional shortening (by 14%) compared to LacZ-transfected myocytes served as a control (2.4±0.3% vs. 2.1±0.2%, respectively; p<0.05). This suggests that RyR2 of these two species is capable of binding to FKBP12 in a functionally relevant manner.To investigate whether FKBP12.6 may represent a new molecular target to improve contractile function, FKBP12.6 was overexpressed by adenovirus-mediated gene transfer in myocytes isolated from failing hearts of rabbits with tachycardia-induced heart failure. To assess the molecular interaction of FKBP12.6 with RyR2 in the rabbit model, co-immunoprecipitation was performed. Contractility of isolated rabbit cardiomyocytes was measured by video-edge detection 24 hours after transfection. The levels of RyR-associated FKBP12.6 were decreased by 40% in failing hearts compared to sham controls. In Ad-LacZ cell population, fractional shortening of failing cardiomyocytes was significantly reduced (by 25%) when compared to sham controls (1.77±0.1%, n=84 vs. 2.35±0.1%, n=101, respectively; p<0.001). In the failing-heart group, cardiomyocytes overexpressing FKBP12.6 showed a significant increase in fractional shortening in comparison with Ad-LacZ transfected cells (1.96±0.1%, n=102 vs. 1.77±0.1%, n=84, respectively; p<0.05), indicating the partial restoration (by 44%) of cardiomyocyte contractility. This suggests that adenoviral FKBP12.6 overexpression restores, in part, fractional shortening of rabbit failing cardiomyocytes and is a strategy to improve contractile function in heart failure.
Keywords: FK506-binding protein; ryanodine receptor; Ca<sup>2+</sup>-release; sarcoplasmic reticulum; Ca<sup>2+</sup>-cycling; heart failure; adenoviral gene transfer
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Die FK-506 Bindungsproteine (FKBP) können in Skelettmuskel (FKBP12) und Herzmuskel (FKBP12.6) die Kalziumfreisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) durch Bindung am Ryanodin Rezeptor (RyR) beeinflussen. FKBP12.6 bindet an den kardialen RyR (RyR2) und FKBP12 ausschließlich an den skelettalen RyR (RyR1), und damit ausschließlich im Skelettmuskel den RyR reguliert. Eine deutlich höhere Expression von FKBP12 im Vergleich zu FKBP12.6 im Myokard zahlreicher Spezies lassen jedoch Zweifel an einer exklusiven Rolle von FKBP12.6 an einer Regulation des RyR2 zu. Daher war der Zweck dieser Untersuchung festzustellen, ob FKBP12 in der Regulation des Kalziumzyklus des Herzens durch die Wechselwirkung mit dem Ryanodin Rezeptor involviert ist.In der Herzinsuffizienz ist die Kalziumfreisetzung des SR gestört. Die defektive Calcium Regulation des RyR2 durch FKBP12.6 könnte an der Pathogenese von Herzinsuffizienz beteiligt sein. Deshalb soll in dieser Arbeit auch die Interaktion von RyR2 mit FKBP12.6 an einem Kaninchenherzinsuffizienz-Model untersucht werden. Ziel ist es zu prüfen, ob FKBP12.6 als neues Target-Molekül" zur Verbesserung der kontraktilen Funktion der kranken Kardiomyozyten dargestellt werden kann.Eine direkte Wechselwirkung zwischen FKBP12 und der RyR2 Isoform wurde durch die GST-pulldown Technik demonstriert. Die humane Rekombinante GST-FKBP12 zeigte eine spezifische Wechselwirkung mit dem RyR2 aus Kaninchen und Mensch. Diese FKBP12−RyR2 Bindung besitzt eine hohe Affinität und kann wie FKBP12.6 FK506 von dem Komplex mit RyR2 verdrängen. Um die physiologischen Konsequenzen dieser neuen Interaktion zu untersuchen, wurde FKBP12 in isolierten Kardiomyozyten vom Kaninchen mittels adenoviralem Gentransfer überexprimiert. Die Überexpression wurde auf mRNA- bzw. Proteinebene mittels RT-PCR und Western Blot verifiziert. Die Kontraktilität von isolierten Kardiomyozyten aus Kaninchen wurde durch Video-Grenzlinienerfassung bestimmt. 48 h nach Transfektion zeigten FKBP12 überexprimierende Kardiomyozyten im Vergleich zu LacZ kontrolltransfizierten Myozyten ein signifikant höheres fractional shortening (2.4±0.3% vs. 2.1±0.2%, p<0.05). Dies bedeutet, dass FKBP12 fähig ist, RyR2 der beiden Spezies regulativ zu binden.Um zu untersuchen, ob FKBP12.6 ein molekulares Ziel zur Kontraktilitätsverbesserung repräsentiert, exprimierten wir FKBP12.6 mittels adenoviralem Gentransfer in isolierten Myozyten herzinsuffizienter Kaninchen. Die Interaktion zwischen FKBP12.6 und RyR wurde mittels Koimmunopräzipitation untersucht. Die Überexpression von FKBP12.6 und beta-Galactosidase als Kontrolle (Ad-LacZ) wurde mittels adenoviralem Gentransfer und 24h Kulturzeit durchgeführt. Danach wurde die Myozytenkontraktilität mittels Video-Grenzlinienerfassung untersucht. In Kardiomyozyten herzinsuffizienter Kaninchen war im Vergleich zu sham-operierten Kaninchen die Menge von RyR assoziiertem FKBP12.6 reduziert. Zellen herzinsuffizienter Tiere zeigten im Vergleich zu sham-operierten Tieren ein signifikant vermindertes fractional shortening (1.77±0.1%, n=84 vs. 2.35±0.1%, n=101, p<0.001). In Zellen herzinsuffizienter Kaninchen führte die FKBP12.6 Überexpression zu einer signifikanten Zunahme des fractional shortening (1.96±0.1%, n=102, vs. 1.77±0.1%, n=84, p@lt0.05), im Sinne einer teilweisen Wiederherstellung der Kontraktilität. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine adenovirale FKBP12.6 Überexpression teilweise das fractional shortening von insuffizienten Kaninchen Kardiomyozyten wieder herstellen kann und als eine Strategie eingesetzt werden könnte, um kontraktile Dysfunktionen des Herzens zu verbessern.
Schlagwörter: FK506-bindendes Protein; Ryanodin Rezeptor; Kalziumfreisetzung; sarkoplasmatisches Retikulum; Kalziumzyklus; Herzinsuffizienz; adenoviraler Gentransfer