Adenovirus-mediated gene transfer of FK506-binding proteins FKBP12.6 and FKBP12 in failing and non-failing rabbit ventricular myocytes

Abstract

Die FK-506 Bindungsproteine (FKBP) können in Skelettmuskel (FKBP12) und Herzmuskel (FKBP12.6) die Kalziumfreisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) durch Bindung am Ryanodin Rezeptor (RyR) beeinflussen. FKBP12.6 bindet an den kardialen RyR (RyR2) und FKBP12 ausschließlich an den skelettalen RyR (RyR1), und damit ausschließlich im Skelettmuskel den RyR reguliert. Eine deutlich höhere Expression von FKBP12 im Vergleich zu FKBP12.6 im Myokard zahlreicher Spezies lassen jedoch Zweifel an einer exklusiven Rolle von FKBP12.6 an einer Regulation des RyR2 zu. Daher war der Zweck dieser Untersuchung festzustellen, ob FKBP12 in der Regulation des Kalziumzyklus des Herzens durch die Wechselwirkung mit dem Ryanodin Rezeptor involviert ist.In der Herzinsuffizienz ist die Kalziumfreisetzung des SR gestört. Die defektive Calcium Regulation des RyR2 durch FKBP12.6 könnte an der Pathogenese von Herzinsuffizienz beteiligt sein. Deshalb soll in dieser Arbeit auch die Interaktion von RyR2 mit FKBP12.6 an einem Kaninchenherzinsuffizienz-Model untersucht werden. Ziel ist es zu prüfen, ob FKBP12.6 als neues Target-Molekül" zur Verbesserung der kontraktilen Funktion der kranken Kardiomyozyten dargestellt werden kann.Eine direkte Wechselwirkung zwischen FKBP12 und der RyR2 Isoform wurde durch die GST-pulldown Technik demonstriert. Die humane Rekombinante GST-FKBP12 zeigte eine spezifische Wechselwirkung mit dem RyR2 aus Kaninchen und Mensch. Diese FKBP12−RyR2 Bindung besitzt eine hohe Affinität und kann wie FKBP12.6 FK506 von dem Komplex mit RyR2 verdrängen. Um die physiologischen Konsequenzen dieser neuen Interaktion zu untersuchen, wurde FKBP12 in isolierten Kardiomyozyten vom Kaninchen mittels adenoviralem Gentransfer überexprimiert. Die Überexpression wurde auf mRNA- bzw. Proteinebene mittels RT-PCR und Western Blot verifiziert. Die Kontraktilität von isolierten Kardiomyozyten aus Kaninchen wurde durch Video-Grenzlinienerfassung bestimmt. 48 h nach Transfektion zeigten FKBP12 überexprimierende Kardiomyozyten im Vergleich zu LacZ kontrolltransfizierten Myozyten ein signifikant höheres fractional shortening (2.4±0.3% vs. 2.1±0.2%, p<0.05). Dies bedeutet, dass FKBP12 fähig ist, RyR2 der beiden Spezies regulativ zu binden.Um zu untersuchen, ob FKBP12.6 ein molekulares Ziel zur Kontraktilitätsverbesserung repräsentiert, exprimierten wir FKBP12.6 mittels adenoviralem Gentransfer in isolierten Myozyten herzinsuffizienter Kaninchen. Die Interaktion zwischen FKBP12.6 und RyR wurde mittels Koimmunopräzipitation untersucht. Die Überexpression von FKBP12.6 und beta-Galactosidase als Kontrolle (Ad-LacZ) wurde mittels adenoviralem Gentransfer und 24h Kulturzeit durchgeführt. Danach wurde die Myozytenkontraktilität mittels Video-Grenzlinienerfassung untersucht. In Kardiomyozyten herzinsuffizienter Kaninchen war im Vergleich zu sham-operierten Kaninchen die Menge von RyR assoziiertem FKBP12.6 reduziert. Zellen herzinsuffizienter Tiere zeigten im Vergleich zu sham-operierten Tieren ein signifikant vermindertes fractional shortening (1.77±0.1%, n=84 vs. 2.35±0.1%, n=101, p<0.001). In Zellen herzinsuffizienter Kaninchen führte die FKBP12.6 Überexpression zu einer signifikanten Zunahme des fractional shortening (1.96±0.1%, n=102, vs. 1.77±0.1%, n=84, p@lt0.05), im Sinne einer teilweisen Wiederherstellung der Kontraktilität. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine adenovirale FKBP12.6 Überexpression teilweise das fractional shortening von insuffizienten Kaninchen Kardiomyozyten wieder herstellen kann und als eine Strategie eingesetzt werden könnte, um kontraktile Dysfunktionen des Herzens zu verbessern.