Präparation und röntgenkristallographische Untersuchungen an archaebakteriellen Box C/D sRNPs und einer neuartigen Glukosyltransferase aus Thermotoga maritima MSB8

Abstract

Ribosomale RNAs werden posttranskriptional durch kleine nukleoläre RNAs (snoRNAs) modifiziert. Dabei kommt es zum einen zur Umwandlung von Uridin in Pseudouridin durch die H/ACA-Box snoRNAs und zum anderen zur 2'-O-Methylierung von Ribose durch Box C/D snoRNAs, wobei beide snoRNA-Familien mit spezifischen Proteinen zu kleinen nukleolären Ribonukleoprotein Partikeln (snoRNPs) assembliert sind. In zellkernlosen Prokaryonten konnten homologe RNAs (sRNAs) und Proteine identifiziert werden, die ebenfalls an der Modifizierung von ribosomalen RNAs beteiligt sind.Ein Komplex aus einer C/D-Box sRNA und den Proteinen aL7, aNop56 und aFibrillarin aus Sulfolobus solfataricus konnte rekonstituiert werden. Die Kristallisation des rekonstituierten Komplexes lieferte jedoch nur Kristalle, die aufgrund ihrer geringen Auflösung (~ 14 Å) nicht für eine Strukturaufklärung verwertbar waren. Eine Analyse der Kristalle zeigte des weiteren, daß der rekonstituierte Komplex wieder dissoziierte und nur ein Komplex aus aFibrillarin und einem degradierten aNop56 gebildet worden war.Das im Jahr 1998 identifizierte Enzym Amylase B aus Thermotoga maritima MSB8 wurde aufgrund seiner Fähigkeit, Stärke und deren Abbauprodukte Amylose und Amylopektin an den α-1,4-glykosidischen Bindungen zu spalten, als α-Amylase deklariert. Eine Einordnung der Amylase B in die Glykosyl-Hydrolase Familie 57 wird zum einen durch die fehlenden, für die Glykosyl-Hydrolase Familie 13 (typische α-Amylasen) charakteristischen Konsensus-Sequenzen in Amylase B und zum anderen durch geringe Sequenzähnlichkeiten und einem gleichen Hydrolysemuster zu einem Mitglied der Glykosyl-Hydrolase Familie 57 gestützt. Die Aufklärung der Amylase B-Struktur, in der das strukturell konservierte (β,α)8-Barrel in einer verzerrten und verkürzten Variante das katalytische Zentrum bildet, festigen die Eingliederung. Ein struktureller Vergleich der katalytischen Domäne von Amylase B mit einer verwandten Struktur aus Thermococcus litoralis, der 4-α-Glukanotransferase, konnte eine Blockierung der Bindungsstelle durch mehrere Aminosäurereste in Amylase B zeigen.