Neue Enzyminhibitoren und Rezeptoragonisten durch Variation funktionaler Schleifen von Mikroproteinen

Abstract

Cystin-Knoten Mikroproteine sind peptidische Biomoleküle mit einer Größe von etwa 28-40 Aminosäuren. Sie sind in der Lage, konformationell extrem stabile dreidimensionale Strukturen einzunehmen, die sich durch die charakteristische Verknüpfung von sechs Cysteinen zu einem Cystin-Knoten und ein dreisträngiges antiparalleles β-Faltblatt auszeichnen. Die Vertreter dieser Proteinfamilie sind in der Natur sowohl in linearer Form als auch mit zyklischem Grundgerüst als Modulatoren biomolekularer Wechselwirkungen mit verschiedensten biologischen Aktivitäten zu finden. In dieser Arbeit wurden auf der Basis des Cystin-Knoten Grundgerüsts durch rationales Protein Design neue Varianten generiert, die vorgegebenen Ansprüchen an die Wechselwirkung mit vorzugsweise therapeutisch relevanten Interaktionspartnern genügen. Im Zuge dessen konnten Mikroproteine synthetisiert werden, die als Monomere mit hoher Affinität an den humanen Thrombopoietin-Rezeptor binden und als linkerverbrückte Homodimere potente Thrombopoietin-Rezeptor Agonisten sind. Zudem konnten durch struktur-basiertes Design potente Inhibitoren der humanen Mastzell-Tryptase entwickelt werden, die alle vier Monomere der tetrameren Serin-Protease blockieren. Als technische Basis für die Herstellung der Mikroprotein Varianten in korrekt gefalteter Form wurde ein neuartiges Expressions- und Reinigungssystem aufgelegt. Neben Escherichia coli wurde mit der Hefe Pichia pastoris als alternativem Expressionsorganismus zum ersten Mal ein eukaryontischer Einzeller für die Expression von Cystin-Knoten Mikroproteinen erschlossen. Schließlich wurde ein Verfahren entwickelt, das durch rekombinante Produktion und postsynthetische chemische Modifizierung einen Zugang zu zyklischen und damit potentiell stabileren Mikroproteinen schafft.