Charakterisierung von SNARE-Proteinen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Abstract

SNARE-Proteine sind in allen Eukaryonten an der Fusion von Transport-Vesikeln mit Zielmembranen beteiligt, wobei sie Komplexe bilden in denen jeweils 3 Q-SNAREs mit einem R-SNARE interagieren. Im ersten Teil der Dissertation wurde über einen Multicopy-Suppressor-Screen versucht, zusätzliche Proteine aufzufinden, die mit dem Hefe-Q-SNARE Vti1p im Transport vom trans-Golgi zur Prävakuole oder zur Vakuole interagieren. Es gelang ein bislang uncharakterisiertes nicht-gessentielles Gen, welches als VTS1 bezeichnet wurde, und das R-SNARE YKT6 als Suppressoren des Wachstumsdefektes und des Defektes im Transport zur Vakuole der temperatursensitiven vti1-2-Mutante zu identifizieren. VTS1 zeigte dabei eine spezifische genetische Interaktion mit VTI1 ausschließlich im letzten Transportschritt zu Vakuole, nicht jedoch im Transport zur Prävakuole. YKT6 interagierte mit VTI1 zusätzlich zu seiner bereits beschriebenen Funktion im retrograden Transport zum cis-Golgi und in der homotypischen Vakuolenfusion auch im Transport zur Prävakuole und Vakuole. Dies deutet darauf hin, dass es sich bei Ykt6p um das fehlende R-SNARE in den SNARE-Komplexen des biosynthetischen Transportes zur Prävakuole (Ykt6p, Vti1p, Pep12p und Syn8p) und Vakuole (Ykt6p, Vti1p, Vam3p und Vam7p) handelt. Im zweiten Teil der Arbeit gelang es über eine Datenbanksuche ein neues Q-SNARE-Protein in Saccharomyces cerevisiae zu identifizieren und charakterisieren, welches als Use1p bezeichnet wurde und ER-lokalisiert ist. Mittels spezifischer Transport-Assays mit temperatursensitiven Mutanten des Proteins konnte gezeigt werden, dass Use1p am retrograden Transport vom cis-Golgi zum ER beteiligt ist. Dieses Ergebnis wurde auch durch starke genetische Interaktionen zwischen USE1 und Genen die für SNAREs des retrograden Golgi-zu-ER-SNARE-Komplexes codieren unterstützt. Anti-Use1p-Antikörper koimmunpräzipitierten außerdem spezifisch SNAREs des retrograden Golgi-zu-ER-SNARE-Komplexes, jedoch nicht solche des anterograden SNARE-Komplexes. Daher scheint der SNARE-Komplex des retrograden Transportes vom cis-Golgi zum ER aus den SNARE-Proteinen Use1p, Ufe1p, Sec22p und Sec20p aufgebaut zu sein.