Yeast Chorismate Mutase: Molecular Evolution of an Allosteric Enzyme
Die Chorismatemutase der Bäckerhefe: Molekulare Evolution eines Allosterischen Enzyms
by Kerstin Helmstaedt née Probst
Date of Examination:2002-10-31
Date of issue:2003-01-30
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Botho Bowien
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Chorismate mutase (CM, EC 5.4.99.5), encoded by ARO7, catalyzes the Claisen rearrangement of chorismate to prephenate in the biosynthesis of the amino acids tyrosine and phenylalanine. The small, dimeric enzyme of the yeast Saccharomyces cerevisiae is allosterically activated by tryptophan and allosterically inhibited by tyrosine. In this work, earlier data in the literature which suggested that chorismate mutase functions in osmoregulation and vacuole biogenesis were disproven. The analysis of several strains containing aro7 point mutations or deletions did not show any other function for CM but its role in amino acid biosynthesis. By fusion to the green fluorescent protein, this protein was localized in the cytoplasm as well as in the nucleus.On the protein level, the intramolecular signal transduction from the allosteric to the active sites occuring upon effector binding was investigated in more detail. Chimeric enzymes were constructed, in which the molecular hinge loop L220s connecting the allosteric and catalytic domain in the dimer interface, were subtituted by the corresponding loops from homologous fungal enzymes. Kinetic analysis verified that this structural component is critical for protein stability and distinguishes between the activation and inhibition signal. This hinge is also involved in dimerization of the protein. Substitution of hydrophobic amino acids in and near this loop by charged residues produced a stable monomeric enzyme variant. This chorismate mutase showed reduced activity and lost allosteric regulation, but the encoding gene complemented phenylalanine and tyrosine auxotrophy of an aro7 mutant strain. These results supported the theory that yeast CM originated from a monomeric, unregulated ancestral protein similar to the Escherichia coli CM by coevolution of regulatory and stabilizing elements.In order to gain further insight into the principles of protein stabilization, the chorismate mutase from Thermus thermophilus was purified and analyzed after cloning of the structural gene aroG. This enzyme was similar to the structurally unique CM from Bacillus subtilis, but in contrast to the latter CM was inhibited by tyrosine. Computer modeling studies revealed that like in other proteins enhanced hydrophilicity on the protein surface, increased hydrophobicity of residues within the tertiary structure as well as the tightening of active site loops stabilized the protein fold.
Keywords: chorismate mutase; yeast; enzyme regulation;osmosensitivity; enzyme stability
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Die Chorismatmutase (CM, EC 5.4.99.5), kodiert durch ARO7, katalysiert die Claisen-Umlagerung von Chorismat zu Prephenat in der Biosynthese von Tyrosin und Phenylalanin. Das relativ kleine, dimere Enzym der Hefe Saccharomyces cerevisiae wird allosterisch durch Tryptophan aktiviert und allosterisch durch Tyrosin inhibiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Theorie widerlegt, dass die Chorismatemutase an der Osmoregulation und Vakuolenentstehung beteiligt ist. Die Analyse einiger Stämme mit punktmutiertem oder deletiertem ARO7-Gen zeigte ausschließlich eine Funktion in der Aminosäure-Biosynthese. Die Fusion an das grün-fluoreszierende Protein ermöglichte die Lokalisierung der CM in Cytoplasma und Kern der Hefezelle.Auf Proteinebene wurde der intramolekulare Signalübertragungsweg von den allosterischen zu den aktiven Zentren näher untersucht. Es wurden Chimären-Enzyme hergestellt, in denen das molekulare Scharnier L220s zwischen der katalytischen und allosterischen Domäne ausgetauscht wurde gegen den entsprechenden Bestandteil homologer Pilzenzyme. Die kinetische Analyse zeigte, dass dieser Proteinteil essentiell ist für die Unterscheidung zwischen dem Signal Aktivierung bzw. Inhibierung. Diese Region ist auch für die Dimerisierung der CM von Bedeutung. Durch Austausch hydrophober Aminosäuren gegen geladene Reste in und in der Nähe dieses Scharniers wurde eine stabile, monomere Enzymvariante hergestellt. Diese CM zeigte reduzierte Aktivität und keine Regulation, aber das kodierende Gen komplementierte die Tyrosin- und Phenylalanin-Auxotrophie der Zellen. Diese Ergebnisse unterstützen die Theorie, dass das Hefeenzym durch gleichzeitige Evolution von Regulations- und Stabilisierungsmechanismen aus einem monomeren, unregulierten Vorläuferprotein entstanden ist, welches dem der Escherichia coli CM ähnlich war. Um weitere Erkenntnisse über die Prinzipien der Proteinstabilisierung zu erhalten, wurde auch die Chorismatmutase on Thermus thermophilus charakterisiert, nachdem das kodierende Gen kloniert war. Dieses Enzym ist ähnlich zu der strukturell einzigartigen Chorismatmutae aus Bacillus subtilis, wird aber, im Gegensatz zu letzterem durch Tyrosin in seiner Aktivität gehemmt. Modellierungsstudien zeigten, dass wie auch bei anderen Proteinen verstärkte Hydrophilität von Oberflächen, erhöhte Hydrophobizität innerhalb der Struktur wie auch die Versteifung von Loops in der Nähe des aktiven Zentrums zur Stabilisierung dieser Proteinfaltung beitragen.
Schlagwörter: Chorismatmutase; Hefe; Enzymregulation; Osmosensitivität; Enzymstabilität