Subcellular Localization of Nicotiana tabacum TGA Transcription Factors
Subzelluläre Lokalisation von TGA Transkriptionfaktoren aus Nicotiana tabacum
by Kaloian Iliev Nickolov
Date of Examination:2003-01-30
Date of issue:2003-02-11
Advisor:Prof. Dr. Christiane Gatz
Referee:PD Dr. Giselbert Hinz
Referee:Prof. Dr. Detlef Doenecke
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Liebl
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Salicylic acid (SA) is an important signaling molecule in the regulation of plant defense against pathogens. as-1-like cis-elements in the promoters of many defense genes mediate SA- and also auxin-inducible gene expression. Those elements are recognized by the ASF-1/SARP protein complex, comprised of members the TGA family of bZIP plant transcription factors. In this work GFP-fusion proteins of TGA2.1, TGA2.2 and TGA1a were created, over-expressed under the control of the HBT promoter transiently in plant protoplasts or stably in transgenic plants and visualized directly in the living cells by fluorescence and confocal laser-scanning microscopy. Most of the fluorescence from the three TGA-GFP fusion proteins was observed predominantly in the nucleus (excluding the nucleolus), still with biochemical methods a small pool of TGA2.1-GFP and TGA2.2-GFP was detected with antiserum recognizing both their C-termini in cytosolic extracts. C-terminal domain fusions of TGA2.2 and TGA1 a at the C-terminus of CHS-GFP were also observed in the cytosol in transient assays; it could not be clarified with certainty whether this localization is due to a lack of the NLS or the presence of a NES. In a gel-retardation in vitro assay the TGA-GFP fusion proteins were still able to recognize the as-1-element and to bind to it in the form of homo- or hetero-dimers with endogenous TGA factors. The TGA-GFP fusion proteins were also able to influence the expression level of the immediate-early GST gene Nt103 upon induction with salicylic acid or auxin in leaves. TGA2.1-GFP and TGA2.2-GFP showed in general a positive effect on the Nt103 mRNA level (2-4-fold increase compared to wild-type), while TGA1a-GFP seemed to influence slightly negatively or not at all the expression of Nt103 in both cases in leaves. The mobility parameters of the different TGA-GFP fusion proteins in the nucleus were studied by FCS, combined with CLMS. While the mobility of the control protein TetR-GFP, which has no endogenous interaction partners, was not changed, subfractions of the TGA-GFP fusion proteins seemed to be influenced. In general a mobile and a less mobile fraction were distinguished. In several measurements the TGA factors in the nucleus were almost completely immobile. The relative ratios between immobile and mobile TGA factors varied in the different cell types tested (longitudal and real epidermal cells, stomata guard cells, trachoma cells). Due to the variability of the data, additional measurements are necessary to clarify with certainty the effect of salicylic acid on the mobility of the TGA factors.
Keywords: TGA factors; subcellular localisation; GFP fusions; CLSM; FCS; mobility
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Die Salicylsäure (SA) ist ein wichtiges Signalmolekül bei der Regulation der pflanzlichen Pathogenabwehr. as-1-ähnliche cis-Elemente in den Promotoren von vielen Abwehrgenen vermitteln SA- und auch Auxin-induzierbare Genexpression. Diese Elemente werden vom ASF-1/SARP-Proteinkomplex erkannt, dessen Hauptkomponenten DNA-Bindeproteine aus der TGA-Familie der pflanzlichen bZIP-Transkriptionsfaktoren sind. In dieser Arbeit wurden Fusionsproteine von TGA2.1, TGA2.2 und TGA1a mit GFP unter der Kontrolle des HBT-Promotors transient in Pflanzenprotoplasten oder stabil in transgenen Pflanzen exprimiert und direkt in lebenden Zellen über Fluoreszenz- und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert. Bei den mikroskopischen Analysen konnte die Fluoreszenz der drei TGA-GFP-Fusionsproteine überwiegend im Kern (mit Ausnahme des Nukleolus) beobachtet werden. Allerdings ließen sich biochemisch mit Hilfe eines Antiserums gegen die beiden C Termini der TGA-Faktoren auch geringe Mengen von TGA2.1-GFP und TGA2.2-GFP in cytosolischen Extrakten der entsprechenden transgenen Pflanzen nachweisen. Fusionen der C terminalen Anteile von TGA2.2 und TGA1a an den C Terminus von CHS-GFP wurden bei transienter Expression ebenfalls im Cytosol beobachtet. Es konnte nicht abschließend geklärt werden, ob dass auf das Fehlen der NLS oder auf die Anwesenheit einer NES zurück zu führen ist. Die TGA-GFP-Fusionsproteine konnten das as 1-Element in vitro in Gelretardationsanalysen erkennen und in Form von Homo-oder Heterodimeren daran binden. Die TGA-GFP-Fusionsproteine waren auch in der Lage, die Expression des frühen (immediate-early) GST-Gens Nt103 in Blättern nach Induktion mit Salicylsäure oder Auxin zu beeinflussen. TGA2.1-GFP und TGA2.2-GFP zeigten im allgemeinen einen positiven Effekt auf die Nt103-mRNA-Menge (2-4-facher Anstieg verglichen mit dem Wildtyp), wobei sich der Effekt stärker auf die SA-induzierte Expression auswirkte als auf die 2,4-D-Proben. TGA1a-GFP schien die Expression von Nt103 in Blättern in beiden Fällen leicht negativ oder gar nicht zu beeinflussen. Die Mobilitätsparameter der verschiedenen TGA-GFP-Fusionsproteine im Kern wurden mit Hilfe von FCS, kombiniert mit CLMS, untersucht. Während die Mobilität des Kontrollproteins TetR-GFP, dass keine endogenen Interaktionpartner hat, einheitlich war, schienen Subfraktionen der TGA-GFP Fusionproteine in ihrer Mobilität beeinflusst. Generell konnte zwischen einer mobileren und einer weniger mobilen Fraktion unterschieden werden. Bei manchen Messungen waren die TGA-Faktoren im Kern sogar gänzlich immobil. Die relative Anteil von weniger mobilen, bzw. immobilen und mobilen TGA-faktoren unterschied sich in den unterschiedlichen analysierten Zelltypen (längliche und echte Epidermiszellen, Schießzellen, Trichomzellen). Um einen eindeutigen Effekt von Salizylsäure auf die Mobilität der TGA-Faktoren festzumachen, sind wegen der großen Variabilität weitere Messungen nötig.
Schlagwörter: TGA Faktoren; subzelluläre Lokalisation; GFP-fusionen; CLSM; FCS; Mobilität