Genetic analysis of stoned B/stonin 2 function in vivo
Genetische Analyse der stoned B/stonin Funktion in vivo
by Muhammed Kasim Diril
Date of Examination:2004-07-04
Date of issue:2005-07-04
Advisor:Prof. Dr. Volker Haucke
Referee:Prof. Dr. Reinhard Jahn
Referee:Prof. Dr. Dr. h.c. Kurt von Figura
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Clathrin-mediated endocytosis at presynaptic nerve terminals is a regulated process tightly coupled to the exocytotic fusion event that requires clathrin, dynamin, AP2 as well as synaptotagmin 1. Stonin 2 is a brain-enriched protein which localizes to axonal vesicle clusters in neurons and clathin/AP2-coated pits in astroglial cells. Its Drosophila orthologue stoned B has a putative role in synaptic vesicle recycling, especially sorting and endocytosis of synaptotagmins. Mammalian stonin 2 interacts with the heterotetrameric clathrin adaptor AP2, via three novel WVXF motifs, and with other endocytic accessory proteins eps15 and intersectin 1 by virtue of its two NPF motifs in its amino-terminal domain. The carboxy-terminal µHD binds to synaptotagmin 1 and is required for proper localization of stonin 2 to synapses in neurons and to coated-pits in astroglial cells. We have recently developed an in vivo interaction assay, to test the interactions between stonins and synaptotagmin family members (1-11). Predominantly cytosolic stonin 2, translocates to the plasmalemma and colocalizes with AP2-coated pits when co-expressed together with synaptotagmins 1, 2, and 9. Transgenic expression of stonin 2 in a stable HEK293 cell line expressing lumenally FLAG-tagged synaptotagmin 1, stimulates endocytic internalization of plasma membrane-stranded synaptotagmin 1 more than 20-fold. Stonin 2 thus physically links synaptotagmin 1 and AP2 and this linkage is required for synaptotagmin 1 endocytosis. Disruption of the stonin 2-AP2 interaction by mutagenesis of WVXF motifs or RNAi-mediated silencing of AP2 expression, inhibits stonin 2-assisted synaptotagmin 1 uptake. In neuroendocrine PC12 cells, stonin 2 assists in targeting of internalized synaptotagmin 1 to SLMVs in addition to facilitating its endocytosis. For a better characterization of its functions, a stonin 2-deficient mouse strain was created by targeted disruption of the stonin 2 gene. Stonin 2 knock-out animals are viable and fertile. Preliminary analysis of synapto tagmin 1 distribution, endocytic recycling, number and morphology of synaptic vesicles in stonin 2 deficient nerve terminals did not display any abnormalities compared to wild-type littermates. Therefore refined experimental procedures seem to be required for characterization of stonin 2 deficiency in neurons and astrocytes. We propose that stonin 2 is an endocytic sorting adaptor for clathrin-mediated endocytosis of synaptotagmins in neurons and neurosecretory cells, as well as yet unidentified cargo molecule(s) in astroglial cells.
Keywords: stonin; synaptotagmin; clathrin mediated endocytsosis
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Clathrin-vermittelte Endozytose an der prä-synaptischen Membran ist ein regulierter Vorgang, der streng an die Exozytose synaptischer Vesikel gekoppelt ist und u. a. von Clathrin, Dynamin, AP2 und Synaptotagmin 1 abhängig ist. Stonin 2 ist ein Protein, das in Hirngewebe angereichert vorgefunden wird und sowohl in axonalen synaptischen Vesikel Clustern in Neuronen als auch in Clathrin/AP2 umhüllten Membraneinstülpungen in Astrogliazellen lokalisiert ist. Für Stoned B, das Orthologe zu humanem Stonin 2 aus Drosophila, wurde eine Rolle in synaptischem Vesikel-Recycling postuliert, insbesondere bei der Sortierung und Endozytose von Synaptotagminen. Stonin 2 interagiert über drei neuartige WVXF Motive mit dem heterotetrameren Clathrin-Adaptor AP2, aber auch mit anderen akzessorischen Proteinen - Eps15 und Intersectin 1 - mittels zwei im amino-terminalen Teil von Stonin 2 lokalisierten NPF Motiven. Die carboxy-terminale µHD (µ-homologe Domäne) bindet an Synaptotagmin und ist für eine korrekte Lokalisierung von Stonin 2 an Synapsen in Neuronen bzw. in Clathrin-umhüllte Membraneinstülpungen in Astrogliazellen verantwortlich. Wir haben einen in vivo Internalisierungs-Assay entwickelt, mit dem es möglich ist die Interaktion zwischen Stonin 2 und verschiedenen Mitgliedern der Synaptotagmin-Familie (Synaptotagmin 1 11) zu testen. Stonin 2, das in Abwesenheit von Synaptotagmin im Zytoplasma zu finden ist, wird bei Coexpression von Synaptotagminen 1, 2 und 9 an die Plasmamembran rekrutiert, wo es mit AP2 colokalisiert. Transgene Expression von Stonin 2 in stabil mit Synaptotagmin 1 transfizierten HEK293-Zellen stimuliert die Endozytose von Synaptotagmin 1, das in Abwesenheit von Stonin 2 and der Plasmamembran verbleibt, mehr als das 20fache. Folglich wird durch Stonin 2 Synaptotagmin an AP2 gekoppelt; diese Verknüpfung wird für die Endozytose von Synaptotagmin benötigt. Zerstört man die AP2/Stonin 2 Interaktion durch Mutagenese der WVXF Motive oder durch RNAi vermittelten Knock-down von AP2, wird die Stonin 2 vermittelte Sy naptotagmin Endozytose inhibiert. In neuroendokrinen PC12 Zellen unterstützt Stonin 2 nicht nur die Endozytose von Synaptotagmin 1, sondern auch dessen weiteren intrazellulären Transport in SLMV. Um die Funktion von Stonin 2 besser zu verstehen, wurde eine Stonin 2 defiziente Maus durch die gezielte Zerstörung des Stonin 2 Gens entwickelt. Stonin 2 Knock-out Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar. Vorläufige Analysen, die sich auf die Verteilung von Synaptotagmin 1, das endozytotische Recycling und die Bestimmung der Anzahl und Morphologie von synaptischen Vesikeln konzentrierten, brachten keine Abnormalitäten im Vergleich zu Wild-Typ Tieren zutage. Für die Charakterisierung der Stonin 2 Defizienz in Neuronen und Astrozyten scheinen daher weitergehende Experimente erforderlich zu sein. Wir postulieren, dass Stonin 2 als endozytotischer Sortierungsadaptor für Clathrin-vermittelte Endozytose von Synaptotagminen in Neuronen und neurosekretorischen Zellen, aber auch von noch unbekannten Cargo-Molekülen in Astrogliazellen fungiert.
Schlagwörter: stonin; synaptotagmin; Clathrin-vermittelte Endozytose