Genetic analysis of stoned B/stonin 2 function in vivo

Abstract

Clathrin-vermittelte Endozytose an der prä-synaptischen Membran ist ein regulierter Vorgang, der streng an die Exozytose synaptischer Vesikel gekoppelt ist und u. a. von Clathrin, Dynamin, AP2 und Synaptotagmin 1 abhängig ist. Stonin 2 ist ein Protein, das in Hirngewebe angereichert vorgefunden wird und sowohl in axonalen synaptischen Vesikel Clustern in Neuronen als auch in Clathrin/AP2 umhüllten Membraneinstülpungen in Astrogliazellen lokalisiert ist. Für Stoned B, das Orthologe zu humanem Stonin 2 aus Drosophila, wurde eine Rolle in synaptischem Vesikel-Recycling postuliert, insbesondere bei der Sortierung und Endozytose von Synaptotagminen. Stonin 2 interagiert über drei neuartige WVXF Motive mit dem heterotetrameren Clathrin-Adaptor AP2, aber auch mit anderen akzessorischen Proteinen - Eps15 und Intersectin 1 - mittels zwei im amino-terminalen Teil von Stonin 2 lokalisierten NPF Motiven. Die carboxy-terminale µHD (µ-homologe Domäne) bindet an Synaptotagmin und ist für eine korrekte Lokalisierung von Stonin 2 an Synapsen in Neuronen bzw. in Clathrin-umhüllte Membraneinstülpungen in Astrogliazellen verantwortlich. Wir haben einen in vivo Internalisierungs-Assay entwickelt, mit dem es möglich ist die Interaktion zwischen Stonin 2 und verschiedenen Mitgliedern der Synaptotagmin-Familie (Synaptotagmin 1 11) zu testen. Stonin 2, das in Abwesenheit von Synaptotagmin im Zytoplasma zu finden ist, wird bei Coexpression von Synaptotagminen 1, 2 und 9 an die Plasmamembran rekrutiert, wo es mit AP2 colokalisiert. Transgene Expression von Stonin 2 in stabil mit Synaptotagmin 1 transfizierten HEK293-Zellen stimuliert die Endozytose von Synaptotagmin 1, das in Abwesenheit von Stonin 2 and der Plasmamembran verbleibt, mehr als das 20fache. Folglich wird durch Stonin 2 Synaptotagmin an AP2 gekoppelt; diese Verknüpfung wird für die Endozytose von Synaptotagmin benötigt. Zerstört man die AP2/Stonin 2 Interaktion durch Mutagenese der WVXF Motive oder durch RNAi vermittelten Knock-down von AP2, wird die Stonin 2 vermittelte Sy naptotagmin Endozytose inhibiert. In neuroendokrinen PC12 Zellen unterstützt Stonin 2 nicht nur die Endozytose von Synaptotagmin 1, sondern auch dessen weiteren intrazellulären Transport in SLMV. Um die Funktion von Stonin 2 besser zu verstehen, wurde eine Stonin 2 defiziente Maus durch die gezielte Zerstörung des Stonin 2 Gens entwickelt. Stonin 2 Knock-out Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar. Vorläufige Analysen, die sich auf die Verteilung von Synaptotagmin 1, das endozytotische Recycling und die Bestimmung der Anzahl und Morphologie von synaptischen Vesikeln konzentrierten, brachten keine Abnormalitäten im Vergleich zu Wild-Typ Tieren zutage. Für die Charakterisierung der Stonin 2 Defizienz in Neuronen und Astrozyten scheinen daher weitergehende Experimente erforderlich zu sein. Wir postulieren, dass Stonin 2 als endozytotischer Sortierungsadaptor für Clathrin-vermittelte Endozytose von Synaptotagminen in Neuronen und neurosekretorischen Zellen, aber auch von noch unbekannten Cargo-Molekülen in Astrogliazellen fungiert.