Molecular mechanisms of AMPA and kainate receptor gating and its implication in synaptic transmission
Molekulare Mechanismen des AMPA- und Kainatrezeptor-Schalt verhaltersund deren Bedeutung in synaptischer Transmission
by Naveen Nagarajan
Date of Examination:2002-10-29
Date of issue:2002-11-25
Advisor:PD Dr. Christian Rosenmund
Referee:Prof. Dr. Axel Zeeck
Referee:Prof. Dr. Jürgen Troe
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
In this work we have studied the biophysical properties of AMPA and kainate receptors, which are found mainly in central synapses. AMPA receptors are thought to be tetrameric in nature. The permeability and gating of AMPA-receptors are controlled by the heteromeric assembly of GluR2 with GluR1/3/4 subunits. To investigate the underlying molecular mechanism, responses from homomeric or heteromeric GluR1/2 receptors were quantified using patch clamp technique by excising outside out patches from transfected HEK cells in conjugation with fast flow application system. The subunits carried markers for controlling rectification and desensitization. We quantitatively monitored both properties as a function of subunit composition and relative expression level. We have found that GluR1/GluR2 receptor subunits do not assemble randomly, but assemble in preferential fashion as heterodimers with two identical subunits positioned on opposite sides of the tetramer. Incorporation of these data in an assembly model indicated that GluR1 binds to GluR2 4-6 times more rapidly during assembly than with GluR1. The second part of the work was to test the effect of two classes of modulators, the benzothiadiazides (cyclothiazide and IDRA 21) and benzoylpiperidines (CX516 and CX546) on the gating kinetics of the AMPA receptor. We found that CX546 reduced the degree of desensitization more potently than CX516 or IDRA 21. The desensitization of GluR2 receptors was inhibited more than that for GluR1 in the presence of CX516/CX546. Analysis of modulator action revealed that CX546 binds specifically to the agonist bound nondesensitized state of the receptor and acts by destabilizing the desensitized conformation of the receptor. The unique properties of CX546 different from the action of cyclothiazide may be beneficial for therapeutical applications. The third part of the work concentrates on characterizing the kinetic properties of kainate receptors. Biophysical studies (of splice variants) were made to understand how the C-terminal deletion of GluR6 subunit affects the gating kinetics. In addition to this we studied the functional and gating properties of various splice variants in GluR5 subunit. We found out the importance of extra 15 amino acids cassette in the N-terminus of GluR5 subunit (GluR5A and GluR5B isoforms) in controlling the gating properties of the receptor.
Keywords: Desensitization; Assembly; Heterodimers; subunit interaction; AMPA modulators; CX546; GluR1; GluR2; GluR5; GluR6; splice variants
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In der vorliegenden Arbeit wurden Eigenschaften von AMPA- und Kainat-Rezeptoren biophysikalisch untersucht. Beide Rezeporen kommen im wesentlichen in zentralen Synapsen vor. AMPA-Rezeptoren bestehen aus vier potentiell verschiedenen Proteinuntereinheiten. Je nach Zusammensetzung aus den Untereinheiten GluR2 mit GluR1, GluR3 oder GluR4 ändern sich funktionale und pharmakologische Eigenschaften des Rezeptors wie Aktivierungskinetik und Affinität.Um dies mechanistisch zu beschreiben, wurden AMPA-Rezeptoren in unterschiedlicher Zusammensetzung in HEK-Zellen durch Transfektion in exprimiert. Mittels patch-clamp-Technik wurden dann aus den Zellen Membranteile (outside-out-patches) gezogen und diese an einem schnellen Perfusions-Versuchsaufbau elektrophysiologisch untersucht. In die Proteinuntereineinheiten wurden jeweils Muationen eingebracht, die die Eigenschaften des Rezeptors jeweils so beeinflussen, daß von dessen Desensitisierungs- und Rektifikationsverhalten auf die Zusammensetzung zurückgeschlossen werden konnte. Die Untersuchungen ergaben, daß AMPA-Rezeptor nicht stochastisch aus den unterscheidlichen Untereinheiten zusammengesetzt werden. Bevorzugt bilden sich Heterodimere, die widerum bevorzgt "über Kreuz" Homodimere bilden, in denen die Untereinheit des einen Types jeweils an einen des anderen binden. Modellierung der Befunde führte zu den gleichen Ergebnissen, wenn GluR1 mit vier- bis sechsfach höherer Affinität Heteromere mit GluR2 bildet als Homomere.Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Modulation der Öffnungskinetik des AMPA-Rezeptors durch vier Stoffe untersucht, die zwei verschiedenen Stoffgruppen angehören: die Benzoylpiperidine CX516 und CX546 sowie die Benzothiazide Cyclothizid und IDRA 21. Alle vier Modulatoren inhibierten die Desensitisierung von AMPA-Rezeptoren, wobei CX546 diese stärker inhibierte als CX516 und IDRA 21. Sowohl CX516 als auch CX546 inhibierten die durch die GluR2-Untereinheit vermittelte Desensitisierung stärker als die durch GluR1-Untereinheit vermittelte. Für CX546 konnte gezeigt werden, daß es spezifisch an den Rezeptor bindet, wenn dieser sich im Agonist-gebundenen Zustand befindet. Das Gleichgwicht zwischen desensitisieren und nicht-desensitisierten Zustand des Rezeptors wird dann in Richtung nicht-desensitisierten Zustand verschoben. Diese Eigenschaft eröffnet für die Anwendung von CX546 ein therapeutisches Potential.Der dritte Teil der Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung kinetischer Eigenschaften von Kainat-Rezeptoren. Dazu wurden Rezptoren erzeugt, in deren Untereineinheiten die Proteinsequenz aus Teilstücken unterschiedlich zusammengestzt waren, und dann wurden für alle Spleißvarianten Öffnungskinetiken der entsprechenden Rezeptors bestimmt. Eine C-terminale Verkürzung der GluR6-Untereinheit veränderte die Funktion des Kainat-Rezeptors nicht signifikant. Der N-Terminus der GluR5-Untereinheit enhält hingegen ein 15 Aminosäure langes Motiv, daß dessen Desensitisierung verstärkte.Somit konnten sowohl für AMPA- als auch für Kainat-Rezeptoren Mechanismen beschrieben beziehungsweise weiterentwickelt werden, die helfen werden, die besonderen funktionalen Eigenschaften dieser Proteine auf molekularer Ebene künftig besser zu verstehen.
Schlagwörter: Desensitivierung; Aufbau zusammensetzung; Heterodimere; Interaktion der untereinheiten; AMPA modulatoren; CX546; GluR1; GluR2; GluR5; GluR6; splice varianten