Molecular mechanisms of AMPA and kainate receptor gating and its implication in synaptic transmission

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden Eigenschaften von AMPA- und Kainat-Rezeptoren biophysikalisch untersucht. Beide Rezeporen kommen im wesentlichen in zentralen Synapsen vor. AMPA-Rezeptoren bestehen aus vier potentiell verschiedenen Proteinuntereinheiten. Je nach Zusammensetzung aus den Untereinheiten GluR2 mit GluR1, GluR3 oder GluR4 ändern sich funktionale und pharmakologische Eigenschaften des Rezeptors wie Aktivierungskinetik und Affinität.Um dies mechanistisch zu beschreiben, wurden AMPA-Rezeptoren in unterschiedlicher Zusammensetzung in HEK-Zellen durch Transfektion in exprimiert. Mittels patch-clamp-Technik wurden dann aus den Zellen Membranteile (outside-out-patches) gezogen und diese an einem schnellen Perfusions-Versuchsaufbau elektrophysiologisch untersucht. In die Proteinuntereineinheiten wurden jeweils Muationen eingebracht, die die Eigenschaften des Rezeptors jeweils so beeinflussen, daß von dessen Desensitisierungs- und Rektifikationsverhalten auf die Zusammensetzung zurückgeschlossen werden konnte. Die Untersuchungen ergaben, daß AMPA-Rezeptor nicht stochastisch aus den unterscheidlichen Untereinheiten zusammengesetzt werden. Bevorzugt bilden sich Heterodimere, die widerum bevorzgt "über Kreuz" Homodimere bilden, in denen die Untereinheit des einen Types jeweils an einen des anderen binden. Modellierung der Befunde führte zu den gleichen Ergebnissen, wenn GluR1 mit vier- bis sechsfach höherer Affinität Heteromere mit GluR2 bildet als Homomere.Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Modulation der Öffnungskinetik des AMPA-Rezeptors durch vier Stoffe untersucht, die zwei verschiedenen Stoffgruppen angehören: die Benzoylpiperidine CX516 und CX546 sowie die Benzothiazide Cyclothizid und IDRA 21. Alle vier Modulatoren inhibierten die Desensitisierung von AMPA-Rezeptoren, wobei CX546 diese stärker inhibierte als CX516 und IDRA 21. Sowohl CX516 als auch CX546 inhibierten die durch die GluR2-Untereinheit vermittelte Desensitisierung stärker als die durch GluR1-Untereinheit vermittelte. Für CX546 konnte gezeigt werden, daß es spezifisch an den Rezeptor bindet, wenn dieser sich im Agonist-gebundenen Zustand befindet. Das Gleichgwicht zwischen desensitisieren und nicht-desensitisierten Zustand des Rezeptors wird dann in Richtung nicht-desensitisierten Zustand verschoben. Diese Eigenschaft eröffnet für die Anwendung von CX546 ein therapeutisches Potential.Der dritte Teil der Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung kinetischer Eigenschaften von Kainat-Rezeptoren. Dazu wurden Rezptoren erzeugt, in deren Untereineinheiten die Proteinsequenz aus Teilstücken unterschiedlich zusammengestzt waren, und dann wurden für alle Spleißvarianten Öffnungskinetiken der entsprechenden Rezeptors bestimmt. Eine C-terminale Verkürzung der GluR6-Untereinheit veränderte die Funktion des Kainat-Rezeptors nicht signifikant. Der N-Terminus der GluR5-Untereinheit enhält hingegen ein 15 Aminosäure langes Motiv, daß dessen Desensitisierung verstärkte.Somit konnten sowohl für AMPA- als auch für Kainat-Rezeptoren Mechanismen beschrieben beziehungsweise weiterentwickelt werden, die helfen werden, die besonderen funktionalen Eigenschaften dieser Proteine auf molekularer Ebene künftig besser zu verstehen.