Studies on Isolation and Identification of Clostridium botulinum Investigating Field Samples Specially from Equine Grass Sickness Cases

Abstract

Das Ziel war die Isolierung und Identifizierung von Clostridium botulinum aus Feldproben von: i) Equine Grass Sickness (EGS)-Fällen (Tier- und Umweltproben) zusammen mit Kontrollproben von Tieren; und ii) Verdachtsfälle auf klassischen Botulismus. Mit Hilfe des Maus Bioassay, MB-ELISA und PCR wurden die Isolate identifiziert. Dabei konnten von 288 untersuchten Proben nur vier Isolate sicher als C. botulinum identifiziert werden, die alle nicht aus EGS-Proben stammten. Dieses Ergebnis konnte zeigen, daß C. botulinum zumindest nicht ausschlaggebend in GS-Proben ist und seine Verbindung mit dieser Krankheit zweifelhaft bleibt. Zwei der vier bestätigten C.-botulinum-Isolate waren vom Typ C, die anderen beiden vom Typ D. Die beiden Typ-C-Isolate stammten aus dem Darminhalt zweier Masthähnchen eines Betriebes, auf dem Botulismus ausgebrochen war; eines der Typ D-Isolate war aus dem Darm eines Rindes mit Botulismus und das andere aus dem Kot eines experimentell mit C. botulinum Typ D und anderen Bakterien infizierten Kaninchens. Die Kolonien der zwei Typ-C-Isolate und des Typ-D-Isolates vom Rind sahen unterschiedlich aus und die Zellen können schwärmen, wenn die Agar-Platten nicht ausreichend trocken sind. Deshalb handelt es sich bei diesen Isolaten möglischerweise um unterschiedliche Stämme und wegen des schwärmenden Verhaltens, über das in der Literatur keine Angaben gefunden werden konnten, müssten sie weiter untersucht werden, um festzustellen, ob sie schon früher isoliert wurden.Toxine von 53 Isolaten wurden mit Botulinum-Antitoxinen im Mäuse-Bioassay neutralisiert. Davon waren 27 von GS-Proben (24 von GS-Fällen und 3 von Kontrollproben). Die neutralisierten Isolate waren Lipase-positive Clostridien (23), Lecithinase-positive Clostridien (23) und E. coli (7). Nur vier von diesen (keine Isolate der EGS-Proben) wurden sicher als C. botulinum identifiziert. Zehn der Lipase-positiven Isolate waren von GS-Proben (alle von kranken Tieren), zehn der Lecithinase-positiven Isolate waren von GS-Proben (9 von kranken Tieren und eines von Kontrollproben) und alle sieben E. coli-Isolate von GS-Proben (5 von kranken Tieren). Vierzehn der 53 Isolate waren mit C. tetani kontaminiert, was als Ursache der falsch-positiven Ergebnisse nachgewiesen wurde. Tetanustoxin von verschiedenen C.-tetani-Isolaten wurde mit verschiedenen Botulinum-Antitoxinen (A-F) neutralisiert, hauptsächlich jedoch mit polyvalenten Typ ABE (AVENTIS BEHRING) und Typ CD-Mischungen (OVI). Die Ergebnisse der Neutralisationen von E. coli, C. perfringens-ähnlichen Bakterien und C. tetani sowie die Verbindung dieser Species mit Proben von GS-Fällen, jedoch nicht mit Kontrollproben, wurden als Hinweis auf eine direkte oder indirekte Rolle bei der Entstehung der EGS betrachtet. Ebenso wurde beobachtet, daß Typen und Anzahl einiger anderer Clostridium Species häufiger in GS-Proben als in Kontrollproben verkommen.Die Isolate, die im Mäuse-Bioassay positiv waren, wurden mit Hilfe der PCR untersucht. Nur sechs von diesen waren dabei positiv, drei waren Typ C und drei Typ D. Ein Typ C-Isolat und ein Typ D-Isolat waren Lipase-negativ; dieses Ergebnisse nicht reproduzierbar. 28 Isolate, die im Mäuse-Bioassay mit der Botulinum CD-Antitoxin-Mischung neutralisiert wurden, wurden im MB-ELISA untersucht. Nur drei waren hier positiv dieselben, die auch in der PCR positiv waren. Von diesen waren zwei Typ C, eines Typ D. Der MB-ELISA war spezifisch, aber weniger sensitiv als andere Arten des Nachweises.Die Ergebnisse der Isolierung und Identifizierung zeigten, daß Botulismus bei Rindern in Deutschland durch die Typen C und D, bei Geflügel durch Typ C hervorgerufen werden kann.Die vorliegende Arbeit empfiehlt den Gebrauch von Fastidious Anaerobic Agar für die Isolierung von Clostridian, einschließlich C. botulinum, C. perfringens und C. tetani. Der hemmende Einfluß anderer Bakterien wurde dadurch bestätigt, dass keines der vier C.-botulinum-Isolate dieser Arbeit nach Anreicherung in flüssigem Medium nachgewiesen werden konnte; sie wurden nur entweder nach Ausstrich, Hitze- oder Alkoholbehandlung isoliert.