Untersuchungen zum Infektionsmodus, immunologischen Nachweis und zur biologischen Bekämpfung von Leptosphaeria maculans (Desm) Ces. & de Not., dem Erreger der Wurzelhals- und Stängelfäule an Winterraps (Brassica napus L.)

Abstract

Aus Komposterde und der Rhizosphäre verschiedener Pflanzen wurden 109 bakterielle und 19 pilzliche Antagonisten mit einer in vitro-Hemmwirkung gegen Leptosphaeria maculans (Anamorph Phoma lingam), dem Erreger der Wurzelhals- und Stängelfäule an Winterraps isoliert. 58 der bakteriellen Isolate hemmten das Myzelwachstum von L. maculans und Verticllium longisporum auf verschiedenen Nährmedien. Viele der Antagonisten waren auch gegenüber anderen pilzlichen Krankheitserregern des Winterraps, Winterweizens sowie der Zuckerrübe wirksam. Aufgrund einer breiten antibakteriellen Wirkung wurden einige Isolate von den nachfolgenden Versuchen ausgeschlossen. Anhand morphologischer und physiologischer Eigenschaften erfolgte frühzeitig eine taxonomische Einordnung, um human- und phytopathogene Bakterien von den ad planta-Versuchen auszuschließen. Die Bestimmung mit den kommerziellen Testsystemen API und Biolog führte zur Identifizierung von Pseudomonas fluorescens, Serratia plymuthica, Paenibacillus polymyxaund Bacillus circulans. 18 der isolierten Bakterienarten und 3 Stämme aus der Antagonisten-Sammlung wurden für das ad planta-Vorscreening im Gewächshaus ausgewählt. Dabei dienten die Siderophorenbildung auf CAS (35 positive Isolate) sowie eine hohe Chitinase- und ß-1,3-Glucanaseaktivität als Kriterium. Darüber hinaus erfolgte eine Überprüfung der Hemmwirkung auf dem nährstoffarmen Strohextraktagar und bei einer niedrigen Temperatur von 8 °C. Alle ausgewählten Bakterien konnten das Wachstum von L. maculans hierbei deutlich hemmen. In Besiedlungsstudien konnte gezeigt werden, dass ausgehend von einer Samenbehandlung eine deutlich bessere Besiedlung der Rapspflanzen durch die Pseudomonaden und von Serratia plymuthica im Vergleich zu den Gram-positiven Bacilli zu beobachten war. Den Befall der Rapscotyledonen mit L. maculans konnten 20 der getesteten 21 Bakterienstämme bis zu 21 Tage nach der Infektion von 6-8 Tage alten Keimlingen in unterschiedlichem Ausmaß vermindern. Pseudomonas fluorescens Gö2I erzielte einen Wirkungsgrad von 73%. Die Isolate Ps. fluorescens RII2 und KAR1, Paenibacillus polymxya HA3e sowie B. circulans KOM1 und KOM19 reduzierten den L. maculans-Befall um 50%. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden 8 Isolate selektiert und auf ihre Hemmwirkung an Jungpflanzen im Entwicklungsstadium BBCH14/15 untersucht. Hierzu wurde eine naturnahe Infektionsmethode, ohne vorherige künstliche Verletzung der Pflanze, unter Verwendung von Pyknidiosporen und Ascosporen entwickelt. Die Antagonisten wurden als Suspensionen (109 cfu/ml) auf den Wurzelhals und die Stengelbasis der Pflanzen appliziert. Zwei Tage später erfolgte die Infektion mit einer Pyknidiosporensuspension (107/ml). Nach weiteren 49 Tagen wurde der Befall mit Hilfe eines im Rahmen dieser Arbeit entwickelten ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) bestimmt. Von 8 Isolaten erwiesen sich Paenibacillus polymxya HA3e, Ps. fluorescens RII2 und B. circulans Kom19 als sehr wirksam. Die kombinierte Anwendung von HA3e und RII2 konnte die Befallsverminderung der Pflanzen im Vergleich zu den Einzelanwendungen von 53.1 % bzw. 42.3 % auf 85.9 % signifikant erhöhen. Zur Quantifizierung des Befalls wurde ein DAS-ELISA optimiert, mit dessen Hilfe auch die Ausbreitung von L. maculans am Wurzelhals und an der Stängelbasis untersucht wurde. Eine systemische Verbreitung des Pilzes in der Pflanze war nicht zu beobachten. L. maculans breitete sich mit zunehmendem Befall auf- und abwärts am Stängelgrund- und im Wurzelhalsbereich, mit einem Maximum im Bereich von 5 cm um die Infektionsstelle herum, aus. Dieser Bereich wurde für die Befallsquantifizierung herangezogen. Der Einfluss des Pilzbefalls auf die Kornertragsbildung wurde mit Hilfe von Analysen an Einzelpflanzen der anfälligen Sorte Cobra untersucht. Eine enge Korrelation wurde zwischen der Ertragsverminderung und dem Befall (r = -0,7159; p = 0,01) ermittelt. Die Ertragsverminderung bei einem starken Befall betrug 28,3%, bei leichtem Befall lediglich 3,3%. Eindeutig pflanzenwachstumsfördernde Effekte konnten bei der Gießbehandlung mit Ps. fluorescens RII2 und Paenibacillus polymxa HA3e nicht festgestellt werden. Phytotoxische Wirkungen traten allerdings dann auf, wenn die Wurzeln der Rapskeimlinge für eine Stunde in eine 5 x 109 cfu/ml konzentrierte Suspension einer dieser beiden Antagonisten eingetaucht wurden. HPLC-analytisch konnte für Ps. fluorescens RII2 die Bildung der Antibiotika DAPG und Pyrrolnitrin sowie anhand colorimetrischer Tests auch HCN und IAA (>1µg/ml) nachgewiesen werden. Pyrrolnitrin zeigte eine fungizide Wirkung gegen L. maculans im Plättchentest bereits bei einer Konzentration von 2 ppm. Cryorasterelektronenmikroskopisch waren Bakterien auf der Oberfläche von Wurzelhals und Stängelbasis der Rapspflanzen nach deren Behandlung mit einer Xanthan-Antagonistensuspension zu erkennen. Die geringen Populationsdichten könnte darauf hindeuten, dass sich Ps. fluorescens R2II und Paenibacillus polymxya HA3e bei geringen Feuchtigkeiten nur schwach auf der oberirdischen Pflanzenoberfläche etablieren können.