Transcriptional regulation of the Human Zfm1/Sf1 Gene

Abstract

Das erste Ziel der hier vorgelegten Arbeit war zu untersuchen, ob die Zytokine IL-1β/TNFα und/oder der Wachstumsfaktor PDGF, ähnlich wie in glatten Gefäßmuskelzellen (GMZ) der Ratte, auch in humanen GMZ die Expression des Gens für den transkriptionellen Repressor Zfm1 hemmen und so die Proliferation dieser Zellen induzieren. Tatsächlich zeigte sich, dass IL-1β/TNFα weder Proliferation auslösten, noch die Zfm1-Expression beeinflussten. Allerdings konnten diese Zytokine nach Hemmung der Zfm1-Expression durch ein spezifisches RNAi-Molekül doch die Zellteilung humaner GMZ stimulieren. Im Gegensatz hierzu konnte der Wachstumsfaktor PDGF wie in Rattenzellen beides, Proliferation induzieren und Zfm1-Expression hemmen. Diese Daten zeigen, dass Zfm1-Repression notwendig ist, um hohe Proliferationsraten in GMZ aufrecht zu erhalten und geben Hinweis, dass die Regulation der globalen Transkription durch Zfm1 auch beim Menschen den zellulären Phänotyp (mit-) bestimmt.Weiterführende Experimente mit Decoy-Oligonukleotiden (dODN) gegen die Transkriptionsfaktoren EGR-1 und SP-1 zeigten, dass beide Proteine be ider Expression von Zfm1 eine Rolle spielen; während SP-1 eine hohe basale Expression vermittelt, spielt EGR-1 eine ungewöhnliche Rolle. Im Falle des Zfm1-Gens führt Bindung der Faktors an den Promoter nicht zu einer Erhöhung der Expression, sondern zu einer deutlichen Hemmung. Um die Bindungsstellen von EGR-1 und SP-1 auf dem Promoter zu definieren, wurde der humane Genpromoter kloniert und in den Reportergenvektor pGL2 kloniert. Dieses Konstrukt führte, gemeinsam mit gezielten Deletionskonstrukten zur Definition eines Komplexes von Bindungsstellen für EGR-1 und SP-1 etwa 200 bp vor dem Nukleotid +1 (ATG) des Zfm1-Gens. Schließlich konnte mit Hilfe eines Koimmun-präzipitationsassays der Mechanismus der PDGF-induzierten EGR-1-ver-mittelten Hemmung der Zfm1-Expression gezeigt werden. Während unter basalen Bedingungen (wahrscheinlich 2 Moleküle) SP-1 (Bindung -191 bis -174) an den Promoter binden, verdrängt EGR-1 bei Aktivierung diese Proteine und führt so zu einer verminderten Expression der Gens.Parallel zu diesen Arbeiten wurden, um ein besseres Verständnis der Mechanismen der Zfm1-1-vermittelten Transkriptionskontrolle zu gewinnen, Ko-Immunpräzipitationen von Kernproteinkomplexen durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, das Zfm1 mit mindestens zwei Komponenten des basalen Transkriptionsfaktors TFIID assoziiert ist, namentlich hTAFII68 und hTAFII80. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, das Zfm1 seine Rolle als transkriptioneller Repressor auf der Ebene der basalen Transkriptions-maschinerie ausübt und dass seine EGR-1-vermittelte Repression wichtig für eine hohe Proliferationsrate ist. ein vertieftes Verständnis der Rolle von Zfm1 bei der Phänotypregulation humaner GMZ in arteriosklerotischen Gefäßen könnte in der Zukunft zur Formulierung eines therapeutischen Konzepts führen um die Bildung der Neointima in betroffenen Gefäßen zu verlangsamen oder zu verhindern.