Regenerationspotenzial CD133+-hämatopoetischer Progenitorzellen der humanen Nabelschnur beim Nierendefekt im Mausmodell
Regenerative potential of human umbilical cord blood derived CD133 positive hematopoietic progenitor cells after kidney injury in a mouse model
by Birgit Hoffschulte
Date of Examination:2009-08-19
Date of issue:2009-03-31
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Anton Müller
Referee:Prof. Dr. Gerhard Anton Müller
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-738
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Description:Dissertation
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Abstract
English
Damage of tubular epithelium is irreversible in most cases. Persisting degradation or chronic inflammatory processes finally lead to renal failure. Up to now, the therapeutic options are limited to dialysis and/or organ transplantation. Many efforts have been made within the past years to study the potential of stem cells in organ regeneration. A recent publication of Bussolati et al. described human kidney progenitor cells as of CD133 positive phenotype. Also basic research was done by several groups using murine transplantation models, but until now xenotransplantation of highly purified human stem cells into murine kidneys is sparely published. To evalulate integration and regeneration potential of CD133 progenitor cells, we have transplanted human umbilical cord blood (UCB) derived CD133 positive progenitor cells directly under the kidney capsule of hypoxic SCID mice. Human male CD133 positive progenitor cells were isolated within 12 h post partum from UCB using density gradient centrifugation (Biocoll), followed by erythrocyte lysis and magnetic activated cell sorting (Miltenyi Biotech) on CD133/1. During anesthesia, highly purified cells (1*106, >99%) were transplanted into the right kidney capsule of female SCID mice (age 14 weeks). Directly pre injection the arteria renalis dextra was ligated for 10 min using an arterial clip. The clip was removed and the cells were injected under the kidney capsule 2 min later. Seven weeks post transplantation mice were sacrificed and kidneys were prepared for immunohistochemistry using either paraffin embedding (2 µm) or cryo sections (5 µm). FISH staining was performed using VYSIS human Y-chromosome probe (green) and DAPI. The migration/ integration of human stem cells into murine kidney could be defined by the use of different molecularbiological and microscopic techniques. Single cells of male origin could be detected exclusively within the proximal tubules (<1%). The results show that human UCB derived CD133 positive progenitor cells do migrate to murine proximal tubules. This xenotransplantation model now enables to further study the underlying mechanisms of stem cell integration and regeneration using new in vivo imaging techniques.
Keywords: CD133 positive hematopoietic progenitor cells; xenotransplantation; ischemia/reperfusion model; HLA staining; fluorescence activated cell sorting (FACS); magnetic activated cell sorting (MACS); fluorescence in situ hybridization (FISH); laser scanning cytometry; laser microdissection
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Eine Schädigung des renalen Tubulusgewebes ist in den meisten Fällen irreversibel. Persistierender Abbau oder chronische inflammatorische Prozesse führen letztendlich zum Nierenversagen. Bisher sind die therapeutischen Optionen auf eine Dialyse beziehungsweise Organtransplantation begrenzt. In den vergangenen Jahren ist das Regenerationspotenzial von Stammzellen bei Organerkrankungen näher untersucht worden. Bussolati et al. beschrieben jüngst ein Reservoir an Progenitorzellen des Phänotyps CD133 in der humanen Niere. Mehrere Forschungsgruppen arbeiteten ebenfalls mit murinen Transplantationsmodellen, doch bisher gibt es kaum Publikationen zur Transplantation - von mittels MACS hoch aufgereinigten - humanen Stammzellen in murine Nieren. Um das Integrationsverhalten und das Regenerationspotenzial CD133-positiver humaner Zellen genauer zu erforschen, transplantierten wir CD133-positive Progenitorzellen der human Nabelschnur direkt unter die Nierenkapsel hypoxisch geschädigter SCID-Mäuse. Humane männliche CD133-positive Progenitorzellen wurden innerhalb von 12 h post partum aus Nabelschnurblut mittels Dichtegradientenzentrifugation (Biocoll), gefolgt von Erythrozytenlyse und Magnet-aktivierter Zellsortierung auf CD133.1 (Miltenyi Biotech) isoliert. Während der Anästhesie wurden diese Zellen (1*106, >99%) in die rechte Nierenkapsel weiblicher SCID-Mäuse (14 Wochen alt) transplantiert. Direkt vor der Transplantation wurde die rechte Arteria renalis über 10 min mit Hilfe einer Arterienklemme ligiert. Die Klemme wurde anschließend entfernt und die Zellen 2 min später unter die Nierenkapsel gespritzt. Sieben Wochen nach der Transplantation wurden die Mäuse getötet und von den Nieren für die Immunhistochemie entweder Paraffinschnitte (2 µm) oder Kryostatschnitte (5 µm) angefertigt. Die FISH-Färbung wurde mit der humanen VYSIS-Y-Chromosomensonde (grün) und DAPI vorgenommen. Mit verschiedenen molekularbiologischen und mikroskopischen Verfahren konnte die Migration/Integration humaner Stammzellen in murine Nieren nachgewiesen werden. Einzelne Zellen männlichen Ursprungs wurden in den proximalen Tubuluszellen detektiert (<1%). Die Ergebnisse zeigen, dass sich humane CD133-positive Progenitorzellen der Nabelschnur in murine proximale Tubuluszellen integrieren. Dieses Xenotransplantationsmodell ermöglicht die Durchführung weiterer Untersuchungen bezüglich der zu Grunde liegenden Mechanismen des Integrations- und Regenerationsverhaltens von Stammzellen durch den Einsatz neuer in-vivo-Bildgebungsverfahren.
Schlagwörter: CD133-positive hämatopoetische Progenitorzellen; Xenotransplantation; Ischämie/Reperfusions-Modell; HLA-Färbung; Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS); Magnet-aktivierte Zellsortierung (MACS); Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH); Laser-Scanning-Zytometrie; Laser-Mikrodissektion
