microRNA expression profile of undifferentiated and differentiating pluripotent cells

Abstract

Eines der Ziele dieser Arbeit war die umfassende Analyse des gesamten microRNAoms von differenzierten maGSCs (multipotent adult Germline Stem Cells-multipotente adulte Keimbahn-Stammzellen) im Vergleich zu differenzierten ESCs (Embryonic Stem Cells-embryonale Stammzellen) in der Maus. Dazu wurden globale miRNA Array Expressionsprofile von nicht differenzierten und differenzierten ESCs und maGSCs auf 129/Sv Hintergrund (die differenzierten Zellen wurden 21 Tage unter Konditionen, die die Differenzierung induzieren, kultiviert) analysiert. Differenzierte ESCs und maGSCs zeigten ein fast identisches miRNA Expressionsprofil. Der einzige Unterschied zwischen differenzierten ESCs und maGSCs betraf miR-17 und miR-20a. Die Expression dieser beiden miRNAs ist in maGSCs nach der Differenzierung nicht gesunken, während beide miRNAs in differenzierten ESCs nur noch auf niedrigem Niveau exprimiert wurden. miR-17 und miR-20a gehören zu der so genannten miRNA-Gruppe der Oncomirs . Diese Gruppe besteht aus den Mitgliedern des miR-17-92 Clusters und seiner Paralogen. Exprimierung von typischen Mitgliedern des miR-17-92 Cluster (miR-17, miR-19b, mir-20a, miR-20b) wurde folglich mittels qRT-PCR in ESCs und maGSCs überprüft (die Zellen wurden 5, 10 und 21 Tage unter Konditionen, die die Differenzierung induzieren, kultiviert). Die Ergebnisse konnten die Array Daten bezüglich der getesteten Zellen bestätigen. Diese Differenzierung-Experimente wurden mit einer zusätzlichen pluripotenten Zelllinie, EGCs (Embryonic Germ Cells-embryonale Keimbahn-Stammzellen), erweitert. Bezüglich der Exprimierung von Mitgliedern des miR-290 und miR-17-92 Clusters zeigten die EGCs während der Differenzierung große Ähnlichkeiten mit maGSCs. Um die Rolle des miR-302 Clusters in der Pluripotenz und in der Differenzierung von pluripotenten Stammzellen ausführlich zu untersuchen, wurden alle vier Mitglieder des miR-302 Clusters in differenzierten ESCs und maGSCs überexprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass das miR-302 Cluster, obwohl es als pluripotent-sp ezifisch beschrieben wurde, die Differenzierung nicht verhindern kann. Dennoch kann dieses Cluster den Charakter der differenzierten Zellen modifizieren. Wenn die Mitglieder des miR-302 Clusters überexprimiert werden, wird die Expression von Mesoderm-Markern, wie z.B. Brachyury, Eomesodermin und Fgf-8, sowie von Keimzelllinien-Markern, wie z.B. Dppa3, und damit die Differenzierung in diese beiden Keimblätter verhindert. Mittels TargetScan Software wurden mehrere mögliche Zielgene des miR-302 Clusters identifiziert. Diese Zielgene beteiligen sich an Bmp4, Nodal und Wnt/ß-catenin Signalwegen, die wichtig für die Entstehung des Mesoderms und der Keimzelllinie sind. Zwei dieser Zielgene, Smad2 und Dkk1, wurden experimentell untersucht, scheinen aber keine Zielgene des miR-302 Clusters zu sein.