Mechanismen der Urocortin-II-induzierten Stimulation der NO-Produktion in isolierten Kaninchen-Ventrikelmyozyten
The mechanisms of Urocortin II-induced nitric oxide production in isolated rabbit cardiac myocytes
by Stefanie Walther
Date of Examination:2010-03-10
Date of issue:2009-08-11
Advisor:PD Dr. Jens Kockskämper
Referee:PD Dr. Jens Kockskämper
Referee:Prof. Dr. Hans Jürgen Steinfelder
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-751
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Description:Dissertation
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Abstract
English
Urocortin II (UcnII), a peptide from corticotropin-releasing factor (CRF) family, is exhibiting beneficial effects in heart failure. In cardiomyocytes, it elicits a cAMP- and Ca2+-dependent positive inotropic and lusitropic effect. Our aim was to characterize the UcnII activities on cardiac nitric oxide (NO) signalling and to evaluate the underlying signalling pathways. UcnII (100nM) caused a time-dependent increase in phosphorylation of Akt at Ser473 and Thr308 and endothelial NO-synthase (eNOS) at Ser1177, which were blocked by wortmannin (0.3 µM) and LY294002 (10 µM), two inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K). Confocal imaging of cellular NO-production and fractional shortening revealed an increase of [NO]i and fractional shortening with a similar time course, that was diminished by inhibitors of eNOS, L-NAME (1mM) and L-NIO (10µM). The inhibitor of protein kinase A (PKA), H89 (5µM), significantly abolished the UcnII-induced phosphorylation of eNOS, but did not affect the phosphorylation of Akt. When both, PI3K/Akt and cAMP/PKA signaling, were inhibited the UcnII-induced synthesis of [NO]i was reduced. We show, for the first time, that in rabbit ventricular myocytes, UcnII activates cAMP/PKA and PI3K/Akt signaling and that both pathways converge in the phosphorylation of eNOS to stimulate NO production and contribute to the increased contractility.
Keywords: Urocortin II; cardiac myocyte; nitric oxide; endothelial nitric oxide synthase; Akt; protein kinase A; cross talk
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Urocortin II (UcnII) ist ein Peptid aus der Corticotropin-Freisetzungs-Faktor (CRF) Familie. UcnII verbessert die Herzfunktion im Gesunden und in der Herzinsuffizienz. In Kardiomyozyten ruft UcnII ein cAMP und Ca2+-abhängigen positiv Inotropen und Lusitropen Effekt hervor. Ziel dieser Studie war es die Ucn-II-vermittelte kardiale Stickstoffmonoxid (NO)-Produktion und die zugrunde liegenden Mechanismen und Signalwege zu untersuchen. UcnII (100nM) bewirkt einen zeitabhängigen Anstieg der Phosphorylierung von Akt an Ser473 und Thr308 und der endothelialen NO-Synthase (eNOS) an Ser1177. Diese Wirkungen wurden durch Inhibitoren der Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K), Wortmannin (0,3 µM) und LY294002 (10µM) nahezu vollständig aufgehoben. Konfokale Bildgebung der zellulären NO-Produktion und der fraktionellen Verkürzung zeigen einen Anstieg des [NO]i und der fraktionellen Verkürzung mit einem ähnlichen Zeitverlauf. Die NO-Produktion wurde durch Hemmung der eNOS mit L-NAME (1mM) und L-NIO (10μM) vermindert. Die Hemmung der Proteinkinase A (PKA) durch H89 (5 μM) unterdrückt zwar deutlich die UcnII-induzierte Phosphorylierung der eNOS, hatte aber keinen Einfluss auf die Phosphorylierung der Akt. Die UcnII-induzierte Steigerung des [NO]i wurden sowohl durch Hemmung des PI3K/Akt-Signalweges als auch durch Blockade des cAMP/PKA-Signalweges, vermindert. Diese Arbeit zeigt erstmals, dass UcnII in Kardiomyozyten den PI3K/Akt-Signalweg aktiviert und dass UcnII über den PI3K/Akt- und cAMP/PKA-Signalweg eine Phosphorylierung der eNOS hervorruft. Die Phosphorylierung der eNOS führt zu einer gesteigerten NO-Produktion und einer Steigerung der Kontraktilität.
Schlagwörter: Urocortin II; Kardiomyozyte; Stickstoffmonoxid; endotheliale NO-Synthase; Akt; Proteinkinase A; cross talk