Optical Analysis of Mitochondrial Function and Heterogeneity in Cultured Hippocampal Astrocytes

Abstract

Diese Dissertation beschreibt die Untersuchung mitochondrialer Heterogenität in kultivierten Astrozyten des neonatalen Rattenhippocampus. Im Rahmen der Neurophysiologie und Pathologie erfuhren sowohl die Rolle von Astrozyten als auch jene zerebraler Mitochondrien während der vergangenen zwei Jahrzehnte eine umfassende Neubewertung. So wurde die Wichtigkeit von Astrozyten als Garanten neuronalen Überlebens und als Modulatoren neuronaler Kommunikation sowie des neuronalen Metabolismuses entdeckt. Die Pathogenese einer Reihe neurodegenerativer Erkrankungen, z.B. der Parkinsonerkrankung oder verschiedener demenzieller Syndrome, konnte auf den Defekt einer funktionierenden Atmungskette zurückgeführt werden. Dies rückte den Einfluss von Mitochondrien auf den zellulären Energieaushalt, die Kalziumhomöostase und Apoptose in diversen Zelltypen in den Forschungsfokus. Selbst intrazellulär scheinen Mitochondrien keine uniform agierenden Organellen darzustellen. Diese Arbeit kombiniert erstmals für diesen Zelltyp hochauflösende konventionelle und Zweiphotonenemissionslasermikroskopie mit der Möglichkeit ratiometrischer Analyse der JC-1 Fluoreszenz, um quantitativ wie qualitativ Aussagen über zelluläre Lage, Form, Transmembranpotenzial (m) sowie Ca2+ Homöostase unter physiologischen wie pathophysiologischen Bedingungen treffen zu können. Es zeigte sich, dass Mitochondrien strategisch um das endoplasmatische Retikulum (ER) gruppiert sind. Periphere Mitochondrien wurden dabei mithilfe des Bildsplitters Dual-View für stärker polarisiert befunden. Mitochondrien unterschieden sich ebenso bezüglich ihrer Reaktion auf metabolische Herausforderungen, die durch die Applikation von Zyanid, FCCP und anderen Chemikalien simuliert wurden. Regelmäßige m Schwankungen erschienen dabei zunehmend eine natürliche Charakteristik von Mitochondrien mit funktionierender Atmungskette und intrazellulärem Ca2+ Haushalt zu sein, wie durch Experimente mit Dantrolen und 2-APB als Blockern der Ryanodin- und IP3-Rezeptoren des ER sowie durch entsprechende Versuche mit dem Ca2+ Indikator Fluo-3, welche eine Unterdrückung sonst bestehender Ca2+ Wellen ergaben, gezeigt werden konnte. Zudem wurden hier erstmalig raumzeitliche Frequenzmuster intrazellulärer Synchronisation und Kinetik dieser m Schwankungen in Echtzeit analysiert, indem der potenziometrische Fluoreszenzfarbstoff JC-1, welcher zwei Emissionswellenlängen hat, verwendet wurde. Eine Korrelationsanalyse des m mit Verteilung und Form von Mitochondrien vervollständigte diese Dissertation.Zusammenfassend verdeutlichen diese Ergebnisse die interaktive Rolle von Mitochondrien im astrozytären Metabolismus und zeitgleich ihre autonome wie auch variable Aktivität selbst innerhalb einer Zelle.