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Etablierung und Charakterisierung einer Tetracyclin-induzierbaren PHD2-Knockdown-HeLa-Zelllinie

dc.contributor.advisorKatschinski, Dörthe Prof. Dr.de
dc.contributor.authorLe-Huu, Sinja Kim-Anhde
dc.date.accessioned2012-04-16T17:23:29Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:41Zde
dc.date.issued2010-07-15de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AFA9-6de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-818
dc.description.abstractProlyl-4-Hydroxylase-Domäne-Proteine 1-3 (PHD1-3) sind sauerstoffabhängige Enzyme, die den Hypoxie-induzierbaren Faktor (HIF-1α) hydroxylieren und damit für den Abbau markieren. HIF-1 ist ein Transkriptionsfaktor, der die Expression von mehr als 70 Genen reguliert, die im weitesten Sinne für die Sauerstoff- und Nährstoffversorgung essentiell sind. Unter Sauerstoffmangel sind die PHDs inaktiv, so dass die HIF-1α-Proteinlevel ansteigen und HIF-1-Zielgene, u. a. das Erythropoietin-Gen, induziert werden. PHD-Inhibitoren werden bereits in Phase-II-Studien getestet. Sie sollen unter anderem zur Therapie der chronischen Anämie bei niereninsuffizienten Patienten eingesetzt werden und die Gabe von rekombinantem EPO ersetzen. Es ist bisher wenig darüber bekannt, ob die PHDs neben der Regulation von HIF-1α noch weitere zelluläre Funktionen beeinflussen. Um HIF-unabhängige PHD-Substrate zu identifizieren und damit auch die Wirkungen und Nebenwirkungen von PHD-Inhibitoren besser einschätzen zu können, wurden Tetracyclin-induzierbare PHD2- und PHD3-Knockdown-Zelllinien etabliert und die Bedingungen für einen möglichst effizienten Knockdown optimiert. Weiterführend wurden die Zelllinien hinsichtlich ihrer Expression von PHD1-3 sowie HIF-1α und dessen Zielgen VEGF (vascular endothelial growth factor) charakterisiert. Im Vergleich zu PHD1 und PHD3 scheint PHD2 unter Normoxie die entscheidende Rolle für die HIF-1α-Regulation zu spielen. Daher wurde die Tetracyclin-induzierbare PHD2-Knockdown-HeLa-Zelllinie 2.1.1-16 genutzt, um PHD2-abhängige Transkriptom- und Proteomveränderungen (Gen-Array und 2D-Gelelektrophorese) zu untersuchen. In der Transkriptomanalyse konnten 7 Gene identifiziert werden, die in Abhängigkeit von dem PHD2-Knockdown unterschiedlich exprimiert werden, jedoch nicht hypoxisch induzierbar sind, d. h. höchstwahrscheinlich nicht durch HIF-1 reguliert werden. Von diesen 7 Genen sind 3 Gene hochreguliert (PGM2L1 (phosphoglucomutase 2 like 1), FAP (fibroblast activation protein, alpha) und PTPRE (protein tyrosine phosphatase, receptor type, E)) und 4 Gene herunterreguliert (AES (amino-terminal enhancer of split), RASSF2 (Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 2), OASL (2"-5"-oligoadenylate synthetase-like) und TSPAN8 (tetraspanin8)). Interessanterweise haben die beschriebenen Gene einige Funktionen gemeinsam: Zellmotilität, Zelladhäsion, Angiogenese, Apoptose und die Aktivität von NF-κB werden teilweise in ähnlicher Weise beeinflusst. In der 2D-Gelelektrophorese wurde ein Proteinspot, der abhängig von dem PHD2-Knockdown reguliert wird, als Cofilin1 identifiziert. In unabhängigen Experimenten wurde bestätigt, dass Cofilin1 sowohl unter Normoxie als auch unter Hypoxie nach Induktion des PHD2-Knockdowns verstärkt in seiner phosphorylierten und damit inaktiven Form vorliegt. Cofilin1 hat einen fördernden Einfluss auf den Aktinfilament-Umbau und spielt damit eine wichtige Rolle für die Zytoskelettdynamik und Zellmotilität. In Übereinstimmung damit konnte nachgewiesen werden, dass die Induktion des PHD2-Knockdowns in 2.1.1-16-Zellen ein vermehrtes Vorliegen von Aktin-Stressfasern zur Folge hat. Außerdem wurde gezeigt, dass eine definierte Wunde im konfluenten Zellrasen bei 2.1.1-16-Zellen nach Induktion des PHD2-Knockdowns signifikant langsamer wieder zuwächst als bei den Vergleichsgruppen. Aufgrund der beschriebenen Ergebnisse kann vermutet werden, dass eine Inhibition von PHD2 unter anderem Einfluss auf Zellmotilität und Zelladhäsion hat. Inwiefern sich dies auf physiologische Vorgänge und pathophysiologische Prozesse wie Wundheilung und Metastasierung etc. auswirkt, muss weiter untersucht werden.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleEtablierung und Charakterisierung einer Tetracyclin-induzierbaren PHD2-Knockdown-HeLa-Zellliniede
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedEstablishment and characterisation of a tetracyclin-inducible PHD2 knock down HeLa cell linede
dc.contributor.refereeWienands, Jürgen Prof. Dr.de
dc.date.examination2009-11-17de
dc.subject.dnb610 Medizin, Gesundheitde
dc.description.abstractengProlyl-4-Hydroxylase Domain (PHD) enzymes 1-3 are oxygen-dependent enzymes, which hydroxylate the hypoxia-inducible factor (HIF) and target it for proteasomal degradation. HIF-1 is the master transcription factor for oxygen-dependent gene expression. Hypoxia inactivates the PHDs and results in increased HIF-1α protein levels. As a consequence HIF-1 target genes like erythropoietin are induced. PHD inhibitors are currently studied in phase II clinical trials for the treatment of chronic anemia in renal failure. Until now there is just little evidence for HIF-independent effectsof the PHDs. To provide information about possible effects and side-effects of PHD inhibitors, we established a tetracyclin-inducible PHD2 and PHD3 knock down HeLa cell line. We characterised these cell lines regarding the expression of PHD1-3, HIF-1α and the HIF-1 target gene vascular endothelial growth factor (VEGF). Furthermore we performed transcriptome and proteome analysis using the newly established tetracyclin-inducible PHD2 knock down HeLa cell line 2.1.1-16. Transcriptome analysis identified 7 genes which are differentially expressed in a PHD2-dependent but not hypoxia-dependent manner. Three genes were found to be upregulated (PGM2L1 (phosphoglucomutase 2-like 1), FAP (fibroblast activation protein, alpha) and PTPRE (protein tyrosine phosphatase, receptor type, E)). Four genes were found to be down-regulated (AES (amino-terminal enhancer of split), RASSF2 (Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 2), OASL (2 -5 -oligoadenylate sythetase-like) and TSPAN8 (tetraspanin8)). Interestingly some of the identified genes are involved in similar functions like cell motility, cell adhesion, angiogenesis, apoptosis and activity of NF-κB. 2D-gelelectrophoresis led to the identification of PHD2-dependent regulation of phospho-Cofilin. In Western Blot analysis we verified the phospho-Cofilin upregulation in normoxia and hypoxia after inducing the PHD2 knock down by tetracyclin treatment. Cofilin is regulated in it`s activity by reversible phosphorylation. Active dephosphorylated Cofilin causes depolymerisation of actin filaments thereby controlling cytoskeleton dynamics and cell motility. In line with the increased phosphorylation of Cofilin in the tetracyclin-treated PHD2 knock down cells, F-actin stress fibres were detected after FITC-Phalloidin staining. This correlates with an inhibited cell migration of PHD2 knock down cells in scratch assays. Taken together the results indicate the influence of PHD2 inhibition on cell motility, cell growth and cell adhesion. The meaning of these findings for physiological functions and pathological processes like wound healing or metastasis has to be investigated in more detail.de
dc.contributor.coRefereeOppermann, Martin Prof. Dr.de
dc.subject.topicMedicinede
dc.subject.gerPHD Knockdownde
dc.subject.gerHIFde
dc.subject.gerHypoxiede
dc.subject.gerCofilinde
dc.subject.engPHD knock downde
dc.subject.engHIFde
dc.subject.enghypoxiade
dc.subject.engCofilinde
dc.subject.bk44.37de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2536-1de
dc.identifier.purlwebdoc-2536de
dc.affiliation.instituteMedizinische Fakultätde
dc.identifier.ppn73789699Xde


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