Identifikation einer funktionellen Kernerkennungssequenz in der Dual-Leucine-Zipper-Bearing Kinase

Abstract

Es existieren viele Hinweise darauf, dass proinflammatorische Zytokine wie z.B. TNF-α und IL-1β an dem Verlust der funktionellen Beta-Zellmasse im prädiabetischen Zustand beteiligt sind. Sie führen dabei zur Aktivierung des MAP-Kinase-Wegs unter Einbeziehung von JNK, was zu einer gesteigerten Apoptoserate von Beta-Zellen führt. Die als JNK-Aktivator be-schriebene DLK ist sowohl in die Induktion von Apoptose in Neuronen und Beta-Zellen als auch in die Hemmung von CREB involviert. In der vorliegenden Arbeit sollte zum einen die Frage nach der subzellulären Lokalisation der DLK geklärt werden. Zum anderen sollte die Auswirkung der DLK auf das Beta-Zellüberleben abhängig von ihrer subzellulären Verteilung untersucht werden. Es konnte unter Zuhilfenahme einer insulinproduzierenden Beta-Zelllinie gezeigt werden, dass die unter basalen Bedingungen größtenteils im Zytoplasma und membranär lokalisierte DLK durch den Einfluss der Zytokine TNF-α und IL-1β verstärkt im Kern lokalisiert war. Die erhobenen Daten wurden durch den Einsatz von Immunfluores-zenzmikroskopie, Elektronenmikroskopie sowie der Zellfraktionierung ermittelt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass eine JNK-Aktivierung zur Kernakkumulation der DLK beitrug. Dieser Befund ließ sich durch eine JNK-induzierte Dissoziation der DLK von ihrem Adapterprotein JIP erklären. Es konnte eine funktionelle zweiteilige Kernerkennungssequenz innerhalb der DLK identifiziert werden, die notwendig für einen suffizienten Kerntransport der DLK war. In der vorliegenden Arbeit wurden zur besseren Charakterisierung zwei Mutanten hergestellt, die Mutationen innerhalb der basischen NLS-Sequenz trugen. Für beide DLK-NLS-Mutanten konnte eine katalytische Aktivität, im Sinne einer Phosphorylierung von JNK, nachgewiesen werden. Durch Mutation der Kernerkennungssequenz verminderte sich sowohl die Zytokin-induzierte Translokation der DLK in den Kern als auch ihre hemmende Wirkung auf die Beta-Zell-protektive CRE-/CREB- und CBP-abhängige Gentranskription. Diese Befunde sind vor dem Hintergrund, dass CREB eine entscheidende Rolle für die Funktion und Aufrechterhal-tung der Beta-Zellmasse spielt, von besonderem Interesse. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass sich der Apoptose-induzierende Effekt der DLK in Beta-Zellen durch Mutation der Kernerkennungssequenz vermindert. Es ist daher davon auszugehen, dass die negativen Effekte der DLK auf die Beta-Zelle sowie ihre Apoptose-induzierende Wirkung zumindest in Teilen durch beeinflussende Mechanismen der DLK im Kern hervorgerufen werden. Eine Hemmung der DLK-Translokation in den Kern könnte daher einen effektiven Mechanismus darstellen, um die Beta-Zelle vor dem schädlichen Einfluss der DLK zu schützen und somit das Fortschreiten des Diabetes mellitus Typ II zu verhindern.