Molecular characterization of Tobacco rattle virus proteins involved in pathogenicity
Molecular characterization of Tobacco rattle virus proteins involved in pathogenicity
by Walid Ghazala
Date of Examination:2007-05-24
Date of issue:2007-09-04
Advisor:Prof. Dr. Mark Varrelmann
Referee:Prof. Dr. Edgar Maiss
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1730
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Description:Dissertation
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Abstract
English
Tobacco rattle virus (TRV), which belongs to the genus Tobravirus , possesses a bipartite positive-single-stranded genome (RNA-1 and -2), and is naturally transmitted by the plant ectoparasites trichdorids nematodes. The virus is infecting the cultivated potato (Solanum tuberosum ssp. tuberosum) and causing spraing symptoms in progeny tubers, severely affecting tuber quality. In this study, a reliable and fast resistance test to screen for TRV resistance in three different potato cultivars, Russet Burbank, Bintje and Saturna, by leaf-inoculation with a full-length RNA-1 cDNA clone and RNA-2 cDNA clone expressing the fluorescent marker protein DsRed of TRV isolate PpK20 was developed. Two different classical resistance reactions fitting to Hypersensitive Resistance (HR) and Extreme Resistance (ER) were identified in the potato cultivars analysed. Agrobacteruim-transient expression assay demonstrated that the 29K movement protein (MP) is the elicitor of both resistance respon ses. On the other hand, it was demonstrated for the first time, using an Agrobacterium-mediated transient assay, the silencing suppression activity of the pathogenicity factor TRV 16K cystein-rich protein (CRP) in planta. Functional mapping of 16K regions using pentapeptide insertion scanning mutagenesis (PSM) suggested a strong functional and possibly structural conservation of TRV 16K. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) analysis of N. benthamiana epidermal cells transiently expressing DsRed C terminal fusions demonstrated that 16K possesses at least two independent bipartite nuclear localization signals (NLSs) in the C-terminal half of the protein. The full-length 16K, in addition to cytoplasmic localization, was able to traffic into the nucleus and nucleolus, indicating a nuclear role of 16K. In contrast, the N-terminal half was localized mainly in the cytoplasm and excluded from the nucleus, suggesting the presence of a nuclear export or a cytoplasmic retention signal.
Keywords: Tobravirus; Solanum tuberosum; spraing; virus-resistance; RNA silencing; suppressor proteins; nuclear localization signal
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Tobacco rattle virus (TRV), Genus Tobravirus , besitzt ein bipartites sinnpositives einzelsträngiges RNA Genom (RNA-1 and -2) und wird natürlicherweise von pflanzenparasitären Nematoden übertragen. An Kartoffeln (Solanum tuberosum ssp. tuberosum) schädigt das Virus durch verursachte Knollennekrosen in Tochterknollen, die die Qualität stark beeinträchtigen können. In diesen Untersuchungen wurde ein schneller und sicherer TRV Resistenztest anhand von drei unterschiedlichen Kartoffelsorten (Russet Burbank, Bintje and Saturna) entwickelt. Dieser basiert auf Blattinokulation mit einem TRV Isolat PpK20 full-length RNA-1 und einem RNA-2 cDNA Klon, wobei letzterer das fluoreszierende Markerprotein DsRed exprimiert. Dabei wurden zwei unterschiedliche Resistenzreaktionen; Hypersensitive Resistenz (HR) und Extreme Resistenz (ER) in den verschiedenen Sorten nachgewiesen. Mithilfe von Agrobacteruim-vermittelter transienter Expression konnte das 29K Transportprotein (MP) als Elicitor von beiden Resistenzreaktionen identifiziert werden. Darüberhinaus wurde, ebenfalls unter Nutzung eines transienten Agrobacterium-vermittelten Expressionssystems, die Aktivität des TRV cystein-rich protein (CRP)Pathogenitätsfaktors 16K als viraler Supressors of gene silencing in planta nachgewiesen. Die funktionelle Kartierung unter Nutzung von "pentapeptide insertion scanning Mutagenese (PSM) wies hochkonservierte funktionelle bzw. strukturelle Bereiche des Proteins nach. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) Untersuchungen an epidermalen Zellen von N. benthamiana, die DsRed C-terminale Fusionen exprimierten, zeigten, dass TRV 16K mindestens zwei unabhängige Kernlokalisationssignale im C terminalen Bereich des Proteins besitzt. Das vollständige 16K Protein wurde sowohl im Cytoplasma, wie auch im Nukleus und Nukleolus detektiert, welches auf eine nukleäre Funktion des Proteins hindeutet. Im Gegensatz dazu konnte der N-terminale Bereich des Proteins hauptsächlich im Cytoplasma gefunden werden, welches auf das Vorhandensein eines Kernexport- oder Cytoplasmabindungssignals hindeutet.
Schlagwörter: Tobravirus; Kartoffeln; virus-resistenz; RNA silencing; suppressor proteins; Kernlokalisationsignale