Molecular characterization of Tobacco rattle virus proteins involved in pathogenicity

Abstract

Tobacco rattle virus (TRV), Genus Tobravirus , besitzt ein bipartites sinnpositives einzelsträngiges RNA Genom (RNA-1 and -2) und wird natürlicherweise von pflanzenparasitären Nematoden übertragen. An Kartoffeln (Solanum tuberosum ssp. tuberosum) schädigt das Virus durch verursachte Knollennekrosen in Tochterknollen, die die Qualität stark beeinträchtigen können. In diesen Untersuchungen wurde ein schneller und sicherer TRV Resistenztest anhand von drei unterschiedlichen Kartoffelsorten (Russet Burbank, Bintje and Saturna) entwickelt. Dieser basiert auf Blattinokulation mit einem TRV Isolat PpK20 full-length RNA-1 und einem RNA-2 cDNA Klon, wobei letzterer das fluoreszierende Markerprotein DsRed exprimiert. Dabei wurden zwei unterschiedliche Resistenzreaktionen; Hypersensitive Resistenz (HR) und Extreme Resistenz (ER) in den verschiedenen Sorten nachgewiesen. Mithilfe von Agrobacteruim-vermittelter transienter Expression konnte das 29K Transportprotein (MP) als Elicitor von beiden Resistenzreaktionen identifiziert werden. Darüberhinaus wurde, ebenfalls unter Nutzung eines transienten Agrobacterium-vermittelten Expressionssystems, die Aktivität des TRV cystein-rich protein (CRP)Pathogenitätsfaktors 16K als viraler Supressors of gene silencing in planta nachgewiesen. Die funktionelle Kartierung unter Nutzung von "pentapeptide insertion scanning Mutagenese (PSM) wies hochkonservierte funktionelle bzw. strukturelle Bereiche des Proteins nach. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) Untersuchungen an epidermalen Zellen von N. benthamiana, die DsRed C-terminale Fusionen exprimierten, zeigten, dass TRV 16K mindestens zwei unabhängige Kernlokalisationssignale im C terminalen Bereich des Proteins besitzt. Das vollständige 16K Protein wurde sowohl im Cytoplasma, wie auch im Nukleus und Nukleolus detektiert, welches auf eine nukleäre Funktion des Proteins hindeutet. Im Gegensatz dazu konnte der N-terminale Bereich des Proteins hauptsächlich im Cytoplasma gefunden werden, welches auf das Vorhandensein eines Kernexport- oder Cytoplasmabindungssignals hindeutet.