X-ray crystallographic studies on two cysteine-rich anticarcinogenic microproteins

Abstract

Zwei cysteinreiche, antikarzinogene Mikroproteine wurden mit röntgenkristallographischen Methoden untersucht.Der aus den Limabohnen isolierte Trypsin-Chymotrypsin Inhibitor (LBTI) gehört zu der Bowman-Birk-Familie der Serin-Protease-Inhibitoren. Die ungewöhnlich hohe Anzahl der Schwefelatome und die hohe Symmetrie der Raumgruppe ermöglichten die Strukturlösung anhand der in-house gemessenen anomalen Streuung von Schwefel. Die LBTI-Moleküle nehmen die der Bowman-Birk-Familie entsprechende bow-tie- >Faltung an. Sie bilden in der Kristallstruktur Dimere derart, dass die reaktiven Schlaufen unabgeschirmt bleiben.Der ternäre Komplex des LBTI mit dessen beiden Zielenzymen konnte mit der Methode des molekularen Ersatzes problemlos gelöst werden. Diese Struktur erhellte die wichtigsten Faktoren, die die Enzymspezifität beeinflussen können, wie die asymmetrische Verteilung der hydrophoben und hydrophilen Oberflächen an der Enzym-Inhibitor-Schnittstelle, oder Konformationsänderungen während einer gleichzeitigen Enzymbindung.Viscotoxine (VT) sind Mitglieder der Alpha- und Beta-Thionin-Familie und besitzen eine cytotoxische Wirkung, indem sie biologische Membrane zerstören können. Die Kristallstruktur der VT A3 Isoform wurde ebenfalls mit Hilfe der anomalen Dispersion des Schwefels gelöst. In diesem Fall verlangte die relativ niedrige Auflösung des anomalen Signals eine Verbesserung des Schweratom-Suchverfahrens für eine erfolgreiche Phasenbestimmung. Die dreidimensionale Struktur der VT A3 Moleküle ähnelt dem Buchstaben "L". Eine positiv geladene Bindungstasche konnte zwischen dem kurzen und langen Schenkel der L-Form lokalisiert werden, wo ein funktionell bedeutsames Phosphation gebunden ist. Die VT A3 Moleküle liegen in der Kristallstruktur als Dimere vor, die weiter zu Tetrameren verbunden sind.Die ausgezeichneten Diffraktionseigenschaften der Kristalle aus der Isoform B2 ermöglichten die Datensammlung bis zu atomarer Auflösung und die Strukturlösung mit ab initio direkten Methoden. Die in der relativen Lage der Monomere beobachteten Unterschiede und Sequenzvergleich der Isoformen deuten darauf hin, dass die für eine hohe cytotoxische Aktivität verantwortlichen hydrophoben Aminosäurereste an der äußeren Oberfläche des längeren L-Schenkels liegen.