Funktionelle Charakterisierung der Replikations- und Rekombinationsfunktionen der RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp) des Potato virus X (PVX)

Abstract

Im ersten Teil der Arbeit wurde das Replikaseprotein des Potato virus X (PVX), vom Typstamm des Genus Potexvirus, ausgewählt, um Regionen zu identifizieren die essentiell sind für die Replikation und subgenomische RNA-Synthese. Ein Replikase-Aminosäure(As)- Sequenzalignment von 16 Potexvirus Spezies führte zu dem Ergebnis einer Homologie aller Potexviren Sequenzen zwischen 34,4 und 65,4 %. Zwei Regionen innerhalb der Consensussequenz, mit einem hohen Anteil an As-Konservierung (1-411 und 617-1437 bezogen auf PVX), sind durch eine hyper-variable Linkerregion voneinander abgegrenzt. Eine Pentapeptide scanning (PS) Mutagenese wurde in einem PVX full-length Klon, welcher das green fluorescent protein (GFP) exprimiert, durchgeführt. Für 69 selektierte PS-Mutanten, bei denen die Insertionen zufällig über den Replikase-ORF verteilt vorlagen, wurde die Position der Insertion bestimmt. Die Replikationsaktivität wurde anhand der GFP-Expression von subgenomischer viraler RNA der PVX Replikase Mutanten ausgewertet. Nur eine funktionsfähige PS-Mutante wurde im N-Terminus an As-Position 430, welche die konservierte Methyltransferase-Domäne des Proteins aufweist, nachgewiesen. In der Linkerregion von As 430-595 konnten neun Mutationen nachgewiesen werden, welche keinen signifikanten Einfluss auf die Replikationsaktivität der Replikase haben. Der Teil des Proteins, welcher die Helikase- und Polymerase-Domäne aufweist, war sehr intolerant gegenüber der PS-Insertionen. Dieses wurde anhand von 24 unabhängigen mehr oder weniger uniform verteilten Mutanten demonstriert.Im zweiten Teil der Arbeit wurde die RNA-Rekombination des PVX charakterisiert. Die Rekombination innerhalb der RNA-Viren ist einer der entscheidenden Faktoren, welcher zur genetischen Variabilität und Evolution beisteuert und als ein weit verbreitetes Phänomen beschrieben wird. Eine in vivo Methode, mit hohem Selektionsdruck, wurde etabliert, um die RNA-Rekombination in PVX näher charakterisieren zu können. Mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens konnte ein GFP-markiertes PVX-Isolat mit einer Hüllproteingenmutation (∆CP) und ein Transkript, welches für ein funktionelles Hüllproteingen + 3´-ntr kodiert, in Nicotiana benthamiana Blattgewebe exprimiert werden. Eine Co-Expression der Konstrukte führte in 69 % der inokulierten Pflanzen zu einer Virusausbreitung, systemischen Infektion und exakten Rekonstitution von Rekombinanten. Ähnliche Ergebnisse wurden mittels Partikelbombardment beobachtet, woraus sich ableiten lässt, dass die Rekombination vermittelt durch A. tumefaciens nicht für das Phänomen verantwortlich ist. Der Zeitpunkt der Rekombination konnte anhand der Agroinfektion von zwei PVX-Mutanten untersucht werden, wobei die 3´- oder 5´-Hälfte des Genoms fehlte und nur eine Überlappung im triple gene block 1 Gen vorlag. D.h., nur wenn das GFP exprimiert wurde, fand Rekombination statt. Zehn verschiedene pentapeptide insertion scanning Replikase-Mutanten, mit der Fähigkeit zu replizieren, vergleichbar mit dem Wildtyp-Virus, wurden in verschiedenen Rekombinationsversuchen bereitgestellt. Zwei benachbarte Mutanten, die einen Einfluss auf die Linkerregion zwischen Methyltransferase- und Helikase-Domänen übernahmen, zeigten, dass sie stark eingeschränkt waren, in ihrer Fähigkeit zu rekombinieren. Die eventuelle Trennung von Replikation und Rekombination innerhalb des Replikase-Moleküls stützt das Model, dass die RNA-Rekombination eine getrennte Funktion des Proteins übernimmt, obgleich der grundlegende Mechanismus noch näher untersucht werden sollte.