Untersuchungen zur Interaktion des Pathogenitätsfaktors P25 des beet necrotic yellow vein virus mit Proteinen der Zuckerrübe (Beta vulgaris L.)
Characterisation of physical interactions between pathogenicity factor P25 of beet necrotic yellow vein virus and the sugar beet proteome (Beta vulgaris L.)
by Heike Thiel
Date of Examination:2009-01-21
Date of issue:2009-05-08
Advisor:Prof. Dr. Mark Varrelmann
Referee:Prof. Dr. Mark Varrelmann
Referee:Prof. Dr. Heiko C. Becker
Referee:Prof. Dr. Petr Karlovsky
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Characterisation of physical interactions between pathogenicity factor P25 of beet necrotic yellow vein virus and the sugar beet proteome (Beta vulgaris L.) In this study protein-protein interactions were performed between P25 pathogenicity factor of the beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) and sugar beet proteins in order to elucidate the sugar beet resistance mechanism against the virus. BNYVV is transmitted by the soil-borne plasmodiophorid Polymyxa betae and induces severe lateral root proliferation, necrosis and strong root and sugar yield reductions. Only the growth of partial resistant genotypes carrying monogenic dominant resistance genes stabilises yield but does not prevent virus infection and replication entirely. The viral RNA3 encodes the gene product P25 which is responsible for the induction of symptoms and virus translocation in the root system as well as for symptom development and yield reduction in susceptible sugar beet genotypes. The molecular basis of the virus-host interactions and P25 functions involved therein are unknown. To better understand P25 functions and the molecular basis of the virus-host interactions, the BNYVV encoded P25 was applied in a yeast two-hybrid screen of an Rz2 resistant sugar beet cDNA library. This screen identified several candidate proteins which were isolated and characterised for their involvement in BNYVV infection and plant defense response. Nucleotide sequencing of 36 identified sugar beet cDNAs and their database analysis resulted in predictions of putative functions and functional domains. Some interactions may be necessary for the virus life cycle or might serve to suppress the sugar beet anti BNYVV defense. Among the candidates are members of the plant ubiquitin/proteasome system and proteins involved in phytohormone signalling, cell cycle and structure as well as stress and pathogen response. The interaction of the candidates with P25 was confirmed by applying bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay in order to exclude false positives. Furthermore a detailed characterisation of one promising candidate was carried out. This candidate showed high significant homology to a kelch repe at-containing F-box (F-box) protein from A. thaliana. The involvement of F-box in the resistance machinery is plausible because F-box proteins are known for the recruitment of transcription factors and the induction of resistance reactions. Additionally, the interaction of P25 with F-box was re-tested and confirmed using a second YTH system and an in vitro pull-down assay based upon glutathion-s-transferase. Because of a cell death reaction induced by F-box during the BiFC application, the expression of pathogenesis related (PR-) proteins from tobacco was verified. The positive PR-protein induction confirmed the cell death reaction as hypersensitive reaction. Finally the function of the F-box protein was confirmed by an additional YTH interaction applying the F-box and known interaction partners of the SCF- (SKP1-Cullin1-F-box) complex which is known as E3 ligase.
Keywords: Benyvirus; beet necrotic yellow vein virus; Rhizomania; Beta vulgaris; protein-protein interactions; yeast-two hybrid
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In dieser Arbeit wurden Protein-Protein Interaktionen zur Identifizierung von Interaktionspartnern des Zuckerrübengenoms mit dem Pathogenitätsfaktor P25 des beet necrotic yellow vein virus durchgeführt. BNYVV, welches durch den bodenbürtigen, biotrophen Plasmodiophoromyceten Polymyxa betae übertragen wird, verursacht die Ausbildung eines Wurzelbartes, der zu hohen Ertrags- und Zuckerverlusten an Zuckerrüben führt. Die Krankheit wird über den Anbau von teilresistenten Genotypen mit monogenen, dominant vererbten Resistenzen, kontrolliert. Diese reduzieren die Virusreplikation in infizierten Haarwurzeln und verhindern die Ausbreitung des Virus in die Hauptwurzel. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden durch molekulare Testsysteme pflanzliche Genprodukte aus resistenten Zuckerrüben-Genotypen, die mit dem Pathogenitätsfaktor P25 des BNYVV interagieren, isoliert und anschließend funktionell charakterisiert, um Hinweise auf pflanzliche Resistenzfaktoren bzw. Zielproteine der Viruspathogenität zu erlangen. Das von der BNYVV RNA3 kodierte Genprodukt P25 ist für die Translokation des Virus im Wurzelsystem, die Ertragsbeeinflussung und die Symptomausprägung in anfälligen Genotypen verantwortlich. Die der Wirt-Pathogen Interaktion zugrunde liegenden Funktionen des Pathogenitätsfaktors P25 sind bisher unbekannt. Zur Identifizierung von Proteinen der Zuckerrübe, die an der möglichen Interaktion mit P25 beteiligt sind, wurde ein Yeast Two-Hybrid (YTH) System als Protein-Protein Interaktionsassay gewählt. Eine aus Wurzel- und Blatt-Gesamt-RNA erstellte cDNA-Bibliothek eines Rz2-resistenten Zuckerrübengenotyps wurde auf Proteininteraktionen mit P25 durchmustert. Nach Durchführung des YTH Screens verblieben 36 Kandidatengene, deren Nukleotid- und Aminosäuresequenzen mittels Datenbankvergleichen auf Homologie zu Sequenzen mit bekannten Funktionen, sowie konservierten, funktionellen Proteindomänen analysiert wurden. Dabei waren Kandidaten, die eine mögliche funktionelle Beteiligung an der Ubiquitinierung, dem Phytoh ormonstoffwechsel oder dem Zellwand- und Zytoskellettaufbau haben von besonderem Interesse. Um sicherzustellen, dass die nachgewiesenen Interaktionen des YTH Screen keine falsch-positiven Reaktionen waren, wurden diese P25 Interaktionen mittels eines in planta bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC) überprüft. Des Weiteren erfolgte die detaillierte Charakterisierung eines im cDNA-Bibliothekscreen identifizierten Kandidaten. In der Datenbankanalyse wies der Kandidat eine signifikante Homologie zu einem kelch repeat-containing F-box (F-box) Protein aus A. thaliana auf. Eine Beteiligung dieses, zu einer Genfamilie gehörenden Kandidatengens an der Resistenzreaktion ist denkbar, da pflanzliche F-box Proteine an der Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren und der Induktion der Resistenzreaktion beteiligt sind. Zusätzlich wurde der F-box Kandidat in einem zweiten YTH System, sowie einem in vitro Interaktionsnachweis, dem Glutathion-S-Transferase "Pull-down"-Assay auf P25 Interaktion getestet und diese bestätigt. Aufgrund einer Zelltodreaktion, die bei der Interaktion des P25 mit dem F-box Protein im BiFC auftrat, wurde die induzierte Expression von verschiedenen pathogenesis related proteins in Tabak überprüft und somit die Induktion einer hypersensitiven Reaktion durch das F-box Kandidatengen nachgewiesen. Für eine Bestätigung, dass es sich bei diesem charakterisierten Kandidaten tatsächlich um ein F-box Protein handelt, wurden im YTH System Interaktionsnachweise mit ausgewählten Proteinen des sogenannten SCF (SKP1-Cullin1-F-box)-Komplexes, einer E3 Ligase vorgenommen und die Wechselwirkung bestätigt.
Schlagwörter: Benyvirus; beet necrotic yellow vein virus; Rizomania; Beta vulgaris; Protein-Protein Interaktion; yeast-two hybrid