Open pulled straw vitrification of murine and caprine embryos and timed deep uterine insemination of goats

Abstract

Die vorliegende Arbeit besteht aus drei separaten Untersuchungen: Die ersten zwei Untersuchungen beschäftigen sich mit der Gefrierkonservierung von Ziegen- und Mäuseembryonen, die mit Hilfe des ´´Open pulled straw´´ (OPS) Vitrifikationsverfahrens durchgeführt wurden. Die dritte Untersuchung befasst sich mit der terminorientierten Besamung bei der Ziege; diese wurde im Anschluss an das bei Ziegen noch selten verwendete Ovsynch- Verfahren durchgeführt.Das Ziel des ersten Versuchs war es, die OPS Methode für caprine Morulae und geschlüpfte Blastozysten zu überprüfen. Die Blastozysten wurden zur Kontrolle entweder mittels OPS oder nach der konventionellen Methode kryokonserviert. Von den 11 Empfängertieren, denen OPS-vitrifizierte Blastozysten implantiert wurden, sind 9 (82%) tragend geblieben und haben abgelammt. Von den 10 Empfängertieren, zu denen konventionell eingefrorene Blastozyten transferiert wurden, blieben 50% tragend und 40% lammten ab. Die Überlebensrate der sich aus vitrifizierten Blastozysten entwickelnden Embryonen lag bei 70% (16/23), die für sich aus konventionell kryokonservierten Blastozysten entwickelnden Embryonen bei 42% (8/19). Signifikante Unterschiede (P<0.05) konnten im ersten Versuch nur für die Ablammungsrate ermittelt werden. 3 der 9 Empfängertiere, denen OPS-vitrifizierte geschlüpfte Blastozysten übertragen wurden, wurden tragend. Nur 2 (22%) davon lammten ab. Die Überlebensrate der Embryonen lag bei 13% (2/15). Von 9 Empfängertieren, denen konventionell kryokonservierte geschlüpfte Blastozyste transferiert wurden, wurden 3 tragend (33%). Alle haben abgelammt. Die Überlebensrate der Embryonen lag bei 19%. Die Überlegenheit der sich aus Blastozysten entwickelnden Embryonen gegenüber den sich aus geschlüpften Blastozysten entwickelnden Embryonen war in der Trächtigkeit und in der Ablammung signifikant (P<0.05). Die Morulae wurden nur mittels OPS Methode kryokonserviert, da sie das konventionelle Einfrieren nicht überleben können. Keines der Empfängertiere, dem eine OPS-vitrifizierte Morulae implantiert wurde, blieb tragend. Die OPS Vitrifikation von caprinen Blastozysten ist effizient und billig und damit eine Alternative zur konventionellen Kryokonservierung. Sie bringt allerdings keine Verbesserung im Einsatz von Morulae und geschlüpften Blastozysten.Im zweiten Versuch wurden die Vorteile der Benutzung von Saccharose im Rahmen der Vitrifikation untersucht und die Vorteile von Saccharose im Auftaumedium im Rahmen der OPS Methode. Es wurden Blastozysten von Mäusen gesammelt, gewaschen und unter dem Mikroskop untersucht. Die Blastozysten wurden ausgewählt und auf einen frischen Tropfen Medium übertragen. Morphologisch intakte Blastozysten wurden mittels der OPS Methode (Vajta et al., 1998) vitrifiziert. Kurze französische Ministraws (0.25 mL, Minitueb, Deutschland) wurden über einer heißen Platte (200° C) aufgewärmt, und so lang auseinandergezogen, bis der ursprüngliche Durchmesser halbiert war. Die so gedehnten Ministraws wurden am dünnsten Punkt geschnitten. Vitrifikationmedien enthalten während des letzten Stepps entweder 0.0, 0.4 oder 0.8 M Saccharose. Auftaumedien enthalten 0.0, 0.25 oder 0.50 M Saccharose für ein Schritt Auftauen. Insegesamt wurden 293 Embryonen tiefgefroren. Jeweils 5-6 Embryonen wurden einer der 9 möglichen Kombinationen aus 3 Vitrifikations- und 3 Auftauverfahren unterzogen und der gesamte Versuch wurde 6-mal wiederholt. Die Vitrifikationslösung mit 0.0 und 0.4 M Saccharose zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Reexpansionsrate, dagegen war diese im Medium mit 0.8 M signifikant niedriger als bei den beiden anderen Behandlungen. Die Schlupfrate unterschied sich signifikant zwischen den drei Saccharosekonzentrationen im Vitrifikationsmedium. Sowohl die Schlupf- als auch die Reexpansionsrate war am niedrigsten, wenn die Embryonen mit 0.8 M Saccharose vitrifiziert wurden. Die höchsten Schlupfraten wurden bei 0.4 M Saccharose erzielt. Die Saccharosekonzentration im Auftaumedium hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Reexpansions- und Schlupfrate. Beide erzielten in Saccharosefreier Auftaulösung in der Tendenz höhere Werte als mit 0.4 M Saccharose. Es bestand keine signifikante Interaktion zwischen Vitrifikations und Auftaumediun. Schlussfolgernd kann festgestellt werden, dass sich eine hohe Saccharosekonzentration im Vitrifkat ionsmedium schädigend auf mittels OPS-Methode kryokonservierte Mäuseblastozysten auswirken kann. Ebenso scheint auch beim Auftauen eine geringe Saccharosekonzentration oder gar kein Saccharose zusatz von Vorteil zu sein.Im Rahmen des dritten Versuches wurden mit 60 multiparen Burenziegen 2 Verfahren zur Terminorientierten Besamung überprüft. Der Versuch wurde während der Deck-Saison (Oktober bis Januar) durchgeführt. Tiere, die 5-12 Tage im Zyklus waren und geeignete Progesteron-Konzentration (>5.0 ng/ml) aufwiesen, wurden zufällig auf 3 Versuchsgruppen aufgeteilt. Die Kontrollgruppe (n=20) wurde mit 5.0 mg PGF2α (Denolytic®, Pfizer) behandelt. Die Ziegen der Gruppe 2 (n=20) wurden mit PGF2α (Denolytic®, Pfizer) behandelt und 48 Stunden später mit 1.0 ml GnRH (Receptal® Intervet), um die Ovulationen zu synchronisieren. Die Ziegen der dritten Gruppe (n=20) wurden wie die der zweiten Gruppe behandelt, zudem wurde die Ovulation hier mittels 500 I.E. hCG (Chorulon® Intervet) induziert. Die Brunsterscheinungen der behandelten Ziegen wurden im Abstand von 8 Stunden mit Hilfe eines Bocks kontrolliert. Die Ziegen in der GnRH- und hCG-Gruppe wurden 16 Stunden nach Gonadotropin-Gabe unabhängig von Brunstsymptomen mit Gefriersperma besamt. Alle Ziegen wurden mittels tief-uteriner Besamung (Sohnrey und Holtz 2005) einmal besamt. Alle 48 Stunden wurden zwischen Tag 2 und 8, und am Tag 21 und 28 Blut-Proben für die Progesteron-Bestimmung entnommen. Die Proben zwischen Tag 2-8 wurden entnommen, um die Rückbildung des C.L. frühzeitig überprüfen zu können. Die Proben von Tag 21 und 28 dienten der Bestimmung der Trächtigkeit. Alle behandelten Ziegen der Kontrollgruppe und der GnRH-Gruppe zeigten Brunssymptome und wurden besamt. In der hCG-Gruppe gab es eine Ziege ohne Brunstsymptome. Diese wurde nicht besamt. Zwischen den drei Gruppen konnten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Ovulation festgestellt werden. Den besten Ovulationsdurchschnitt zeigte die Kontrollgruppe (2.4 ± 0.27); die hCG-Gruppe erzielte den niedrigsten Ovulationsdurchschnitt (1.5 ± 0.26). Hier blieben 5 Ziegen ohne Ovulation. Die Trächtigkeitsraten lagen bei 60% in der Kontrollgruppe, 50% in der GnRH-Gruppe und 35% in der hCG Gruppe. Eine frühzeitige CL Rückbildung wurde bei 5% der Ziegen in der Kontrollgruppe festgestellt, bei 40% der Ziegen in der GnRH-Gruppe und bei 33% in der hCG-Gruppe (33%). Anhand der Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass Ovsynch Verfahren für Terminorientierten Besamung in Ziegen erfolgreich ist. Aber, hCG könnte nicht das Problem von kurz-zyklus in Ziegen lösen.