Practical approaches to macromolecular X-ray structure determination
Angewandte Methoden zur Röntgenstrukturbestimmung von Makromolekülen
by Andrea Thorn
Date of Examination:2011-06-23
Date of issue:2011-11-21
Advisor:Prof. Dr. George M. Sheldrick
Referee:Prof. Dr. George M. Sheldrick
Referee:Dr. Birger Dittrich
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Size:37.1Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The X-ray structure determination of macromolecules is unsurpassed in precision and detail. However, such structures cannot be derived directly from X-ray diffraction data. Phases and a molecular model are needed for the interpretation of the measured reflections; the structure needs to be solved.In this dissertation, practical approaches for the structure solution finding the phases and refining the model - are given. Two unknown protein structures were solved and a new tool for the analysis of anomalous and heavy-atom density in structures was developed. The structure of human RNase T2 was solved by molecular replacement (MR) with the program PHASER in combination with SHELXE. It is shown that in cases where MR cannot clearly solve a structure, or the correct solution is not clearly indicated, density modification and auto-tracing with SHELXE can provide additional phase information and clearly point to the correct solution.The X-ray structure of Hellethionin D from Helleborus purpurascens was solved with the NMR structure ensemble as starting point. The program ARCIMBOLDO allowed for a multi-solution MR approach, and the phase information was combined with weak phase information from anomalously scattering atoms in the structure. Again, density modification and auto-tracing in SHELXE served to improve the phases, to minimize model bias and to validate MR solutions. Why the structure could not be determined by conventional sulfur-SAD (single wavelength anomalous diffraction) phasing remains unclear. Comparison with artificial data suggests that better understanding of the nature of the disordered solvent regions in combination with the anomalous signal might lead to an answer. The evaluation of the anomalous signal led to the development of the program ANODE, which estimates anomalous (or heavy-atom) density. This tool allows for even very weak anomalously scattering atoms to be located in the structure. It could be shown that ANODE can serve for structure validation, to visualize radiation damage and for MR-SAD phasing. The program also gives a good indication of the mean phase error of the model employed and the quality of long-wavelength data sets. ANODE supplements experimental phasing in SHELX and can be easily automatized.To make macromolecular refinement in SHELXL more feasible at medium resolution, two rigid-bond restraints for the refinement of macromolecular structures in SHELXL were developed and tested. For a highly automatized and robust test procedure, several scripts and a test structure library were prepared. Also, a new constraint has been introduced to SHELXL, which can be used to prohibit ADPs from becoming non-positive definite. While the restraints could not be proven to enhance the macromolecular model in all cases, the constraint will be implemented in the distributed version of SHELXL.
Keywords: anomalous signal; anomalous density; anode; MR-SAD; SAD; S-SAD; phasing; refinement; ADP; human RNase T2; Hellethionin D; SHELX; rigid-bond restraint; XNPD
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Die Einkristallstrukturanalye von Makromolekülen ist unübertroffen in Präzision und Detailgenauigkeit. Allerdings können derartige Strukturen nicht direkt aus den Röntgenbeugungsdaten berechnet werden. Um die gemessenen Reflexe zu interpretieren, werden Phasenwinkel und ein Modell des Moleküls benötigt; die Struktur muss bestimmt werden. In der vorliegenden Dissertation werden neue Zugänge zur Strukturbestimmung Phasierung und Verfeinerung des Modells - aufgezeigt. Zwei bislang unbekannte Proteinstrukturen wurden gelöst und ein neues Programm zur Analyse anomaler und Schweratom-Dichte entwickelt. Die Struktur menschlicher RNase T2 wurde mittels molekularen Ersatz (MR) mit dem Programm PHASER in Kombination mit SHELXE gelöst. In Fällen, in denen MR eine Struktur nicht klar lösen oder die richtige Lösung nicht klar unterschieden werden kann, ist SHELXE in der Lage, durch Dichtemodifikation und Auto-Tracing zusätzliche Phaseninformation zu liefern und eine korrekte Lösung zu identifizieren.Die Röntgenstruktur von Hellethionin D aus Helleborus purpurascens wurde ausgehend von der NMR-Struktur derselben Verbindung gelöst. Das Programm ARCIMBOLDO ermöglicht eine multi-solution -Herangehensweise für den molekularen Ersatz. Die so gewonnenen Phaseninformationen wurden mit den schwachen Phaseninformationen aus den anomal streuenden Atomen in der Struktur kombiniert. Wiederum wurde SHELXE benutzt, um die resultierenden Phasen zu verbessern, den Einfluss des NMR-Modells auf die neue Struktur zu minimieren und potentielle MR Lösungen zu validieren. Dies führte zu einer erfolgreichen Phasierung der Struktur. Es bleibt allerdings unklar, warum Hellethionin D nicht durch konventionelle Schwefel-SAD (single wavelength anomalous diffraction) Phasierung gelöst werden konnte. Der Vergleich mit künstlich erzeugten Röntgendaten deutet darauf hin, dass ein besseres Verständnis der ungeordneten Lösungsmittelbereiche im Kristall und deren Einfluss auf das anomale Signal zu einer Erklärung führen könnte.Der Versuch der Einschätzung des anomalen Signals führte zur Entwicklung des Programms ANODE, welches anomale (oder Schweratom-)Dichte abschätzt. Dies ermöglicht die Lokalisierung selbst schwach anomal streuender Atome in einer Struktur. Es wird gezeigt, dass ANODE zur Strukturvalidierung, für MR-SAD und zur Visualisierung von Strahlenschaden verwendet werden kann. Das Programm gibt auch einen guten Anhaltspunkt für den mittleren Phasenfehler eines Strukturmodells und der Qualität eines Datensatzes, der bei langer Wellenlänge gemessen wurde. ANODE ergänzt die experimentelle Phasierung mit SHELX und kann einfach automatisiert werden.Um die Verfeinerung von Makromolekülen bei mittlerer Auflösung in SHELXL zu verbessern, wurden zwei Rigid-bond Restraints entwickelt und getestet. Verschiedene Skripte und eine Testbibliothek wurden angelegt, um die Testprozedur möglichst robust und automatisch zu machen. Des Weiteren wurde ein neuer Constraint eingeführt, der nur positive Auslenkungsparameter zulässt. Während nicht bewiesen werden konnte, dass die Restraints in allen Fällen eine Verbesserung des Modells darstellen, wird der neue Constraint in die verteilte Version von SHELXL implementiert werden.
Schlagwörter: anomales Signal; anomale Dichte; anode; MR-SAD; SAD; S-SAD; Phasierung; Verfeinerung; Auslenkungsparameter; menschliche RNase T2; Hellethionin D; SHELX; rigid-bond restraint; XNPD