Practical approaches to macromolecular X-ray structure determination

Abstract

Die Einkristallstrukturanalye von Makromolekülen ist unübertroffen in Präzision und Detailgenauigkeit. Allerdings können derartige Strukturen nicht direkt aus den Röntgenbeugungsdaten berechnet werden. Um die gemessenen Reflexe zu interpretieren, werden Phasenwinkel und ein Modell des Moleküls benötigt; die Struktur muss bestimmt werden. In der vorliegenden Dissertation werden neue Zugänge zur Strukturbestimmung Phasierung und Verfeinerung des Modells - aufgezeigt. Zwei bislang unbekannte Proteinstrukturen wurden gelöst und ein neues Programm zur Analyse anomaler und Schweratom-Dichte entwickelt. Die Struktur menschlicher RNase T2 wurde mittels molekularen Ersatz (MR) mit dem Programm PHASER in Kombination mit SHELXE gelöst. In Fällen, in denen MR eine Struktur nicht klar lösen oder die richtige Lösung nicht klar unterschieden werden kann, ist SHELXE in der Lage, durch Dichtemodifikation und Auto-Tracing zusätzliche Phaseninformation zu liefern und eine korrekte Lösung zu identifizieren.Die Röntgenstruktur von Hellethionin D aus Helleborus purpurascens wurde ausgehend von der NMR-Struktur derselben Verbindung gelöst. Das Programm ARCIMBOLDO ermöglicht eine multi-solution -Herangehensweise für den molekularen Ersatz. Die so gewonnenen Phaseninformationen wurden mit den schwachen Phaseninformationen aus den anomal streuenden Atomen in der Struktur kombiniert. Wiederum wurde SHELXE benutzt, um die resultierenden Phasen zu verbessern, den Einfluss des NMR-Modells auf die neue Struktur zu minimieren und potentielle MR Lösungen zu validieren. Dies führte zu einer erfolgreichen Phasierung der Struktur. Es bleibt allerdings unklar, warum Hellethionin D nicht durch konventionelle Schwefel-SAD (single wavelength anomalous diffraction) Phasierung gelöst werden konnte. Der Vergleich mit künstlich erzeugten Röntgendaten deutet darauf hin, dass ein besseres Verständnis der ungeordneten Lösungsmittelbereiche im Kristall und deren Einfluss auf das anomale Signal zu einer Erklärung führen könnte.Der Versuch der Einschätzung des anomalen Signals führte zur Entwicklung des Programms ANODE, welches anomale (oder Schweratom-)Dichte abschätzt. Dies ermöglicht die Lokalisierung selbst schwach anomal streuender Atome in einer Struktur. Es wird gezeigt, dass ANODE zur Strukturvalidierung, für MR-SAD und zur Visualisierung von Strahlenschaden verwendet werden kann. Das Programm gibt auch einen guten Anhaltspunkt für den mittleren Phasenfehler eines Strukturmodells und der Qualität eines Datensatzes, der bei langer Wellenlänge gemessen wurde. ANODE ergänzt die experimentelle Phasierung mit SHELX und kann einfach automatisiert werden.Um die Verfeinerung von Makromolekülen bei mittlerer Auflösung in SHELXL zu verbessern, wurden zwei Rigid-bond Restraints entwickelt und getestet. Verschiedene Skripte und eine Testbibliothek wurden angelegt, um die Testprozedur möglichst robust und automatisch zu machen. Des Weiteren wurde ein neuer Constraint eingeführt, der nur positive Auslenkungsparameter zulässt. Während nicht bewiesen werden konnte, dass die Restraints in allen Fällen eine Verbesserung des Modells darstellen, wird der neue Constraint in die verteilte Version von SHELXL implementiert werden.