Photoaktivierungsfähige Rhodamine als Bio-Calcium-Sensoren und Markierungen für Tetracystein-Tags in Proteinen
Photoactivable Rhodamines as Bio-Calcium Sensors and Labels for the Tetracysteine-Tags in Proteins
von Sergey Yan
Datum der mündl. Prüfung:2011-01-28
Erschienen:2011-02-25
Betreuer:Prof. Dr. Armin de Meijere
Gutachter:Prof. Dr. Armin de Meijere
Gutachter:Prof. Dr. Stefan Hell
Zum Verlinken/Zitieren:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-2030
Dateien
Name:yan.pdf
Size:2.57Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Lizenzbestimmungen:
Zusammenfassung
Englisch
New xanthenes with differently located azacrown ether residues were conceived and synthesized, and their spectral as well as calcium-binding properties evaluated. Three derivatives with an azacrown ether ring fused with a rhodol fluorophore were prepared (one with a secondary amino group and the other two with tertiary amino groups additionally bearing an ethyl group and an acetic acid residue). Also one derivative with the azacrown ether ring connected to the fluorophore was prepared. It was found, that the fluorescence signal of the sensor with an ethyl group at the nitrogen atom of the azacrown ether ring strongly increases in the presence of calcium (for [Ca2+] in the range of 5 120 mM). As a part of this study, a synthetic route towards photoswitchable rhodol spiroamides was developed. By photoactivation under irradiation with UV light at 366 nm in toluene solution, these spiroamides gave transient fluorescent products. An effective route for the synthesis of N-methylphthalimide derivatives, fused at positions 4 and 5 with the aza-15-crown-5 ether moiety was developed. These compounds are key precursors to the potential rhodamine-based calcium sensors. Adducts of the photoactivatable Rhodamine S and its fluorescent analogue with the spirolactam arsenic hairpin binder (SplAsH) were synthesized and characterized. The binding properties of these adducts with a peptide containing the tetracysteine tag (GSSGCCPGCC) were evaluted fluorometrically in a competitive experiment with the fluorescein arsenic hairpin binder (FlAsH). The binding ability of the new SplAsH markers with GSSGCCPGCC-peptide is 7 times higher than that of FlAsH. The isolated proteins carrying tetracysteine tags can be labelled selectively with the new SplAsH-markers. However, the same markers did not show any selective staining, if the proteins were integrated into the cell structures.
Keywords: Fluorescent dyes; calcium sensors; biarsenical probes; FlAsH; SplAsH; xanthenes; tetracysteine tag; labelling; calcium indicators; azacrown ether; rhodol
Weitere Sprachen
Neue Xanthene mit verschieden angeordneten Azakronenether-Resten wurden entworfen und synthetisiert, und deren spektralen sowie calciumbindenden Eigenschaften untersucht. Drei Derivaten mit einem Azakronenether-Ring, der mit einem Rhodol-Fluorophor verschmolzen ist, wurden hergestellt (einer mit einer sekundären Aminogruppe und die andere beiden mit tertiären Aminogruppen, die zusätzlich eine Ethylgruppe und einen Essigsäure-Rest tragen). Ein Derivat mit einem Azakronenetherring, der ist an den Fluorophor gekoppelt ist, wurde auch synthetisiert. Es wurde gefunden, dass das Fluoreszenzsignal von dem Sensor mit einer Ethylgruppe am Stickstoffatom des Azakronenether-Rings in der Anwesenheit von Calcium stark zunimmt (in einem Konzentrationsbereich von 5 120 mM). Ein synthetischer Zugang zu photoschaltbaren Rhodolspiroamiden wurde als der Teil dieser Arbeit entwickelt. Nach Photoaktivierung mit UV-Licht (366 nm) in einer Toluol-Lösung haben diese Spiroamide kurzlebige fluoreszierende Produkte ergeben. Ein effektiver Weg für die Synthese von N-Methylphthalimid-Derivaten, die an den Positionen 4 und 5 mit einem Aza-15-kronen-5-ether-Rest kondensiert sind, wurde entwickelt. Diese Verbindungen sind Schlüsselverbindungen bei der Synthese von potenziellen Calciumsensoren auf Rhodaminbasis. Addukte des photoaktivierbaren Rhodamin S und seines fluoreszierenden Analogons mit dem Spirolaktam-Arsen-Haarnadel-Binder (SplAsH) wurde synthetisiert und charakterisiert. Die Bindungseigenschaften dieser Addukte mit einem das Tetracystein-Tag enthaltenden Peptid (GSSPGCCPGCC) wurde untersucht durch Fluoreszenzmessungen in Vergleich mit dem Fluorescein-Arsen-Haarnadel-Binder (FlAsH). Die Bindungfähigkeit des SplAsH-Markers an das GSSGCCPGSS-Peptid ist 7-mal höher als die für FlAsH. Die isolierten Proteine, die ein Tetracystein Tag tragen, können selektiv mit der neue SplAsH-Markierung kenntlich gemacht werden. Dennoch, zeigte die gleiche Markierung keine selektive Färbung, wenn die Proteine in die Zellenstruktur eingebettet waren.
Schlagwörter: Fluoreszierende Farbstoffe; Calcium Sensoren; Biarsenische Proben; FlAsH; SplAsH; Xanthene; Tetracystein-Tag; Markierung; Calcium Indikatoren; Azakronenether; Rhodol