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Dynamische Strukturen am Zellcortex: Aktivierbarkeit und Akkumulation von Ezrin in Abhängigkeit von PIP2

dc.contributor.advisorSteinem, Claudia Prof. Dr.de
dc.contributor.authorBosk, Sabinede
dc.date.accessioned2011-03-23T15:08:58Zde
dc.date.accessioned2013-01-18T10:31:37Zde
dc.date.available2013-01-30T23:51:22Zde
dc.date.issued2011-03-23de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B08F-Ade
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-2022
dc.description.abstractIm Rahmen dieser Arbeit wurde der Aktivierungsprozess von Ezrin, welches in vivo die Plasmamembran mit dem Cytoskelett verknüpft, anhand von wohldefinierten Modellmembransystemen detailliert untersucht. Dabei war von besonderem Interesse, den Einfluss der Bindung des Lipids Phosphytidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) sowie der Phosphorylierung auf die Aktivierung des Proteins sowie mögliche Synergien zu analysieren und zu quantifizieren. Die verwendeten planaren Modellmembranen enthielten entweder Ni-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-([N(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiessigsäure]succinyl) (DOGS-NTA-Ni) zur gerichteten Immobilisierung der Proteine über einen N-terminalen Hexahistidin-tag oder PIP2 als natürlichen Bindungspartner von Ezrin. Die Charakterisierung der Bindung von Ezrin wt sowie zweier Mutanten die unphosphorylierbare sowie die pseudophosphorylierte Form des Proteins an festkörperunterstützte Membranen erfolgte mittels Quarzmikrowaagetechnik. So konnten für alle drei Proteine eine hohe Affinität mit Bindungskonstanten im Bereich von 10 nM und eine hohe Belegungsdichte auf beiden Membransystemen bewiesen werden. Anhand einer Variation der Lipidzusammensetzung der festkörperunterstützten Membran konnte geschlussfolgert werden, dass Ezrin über mehrere PIP2-Lipide an die Membran gebunden wird. Fluoreszenzmikroskopische Studien sowie eine detaillierte Analyse des Bindungsverhaltens von Ezrin konnten zeigen, dass attraktive Protein-Protein-Wechselwirkungen zur Bildung von Proteinclustern auf der Oberfläche führen. Messungen mit einer C-terminal verkürzten Version von Ezrin konnten die beobachtete intermolekulare attraktive Wechselwirkung auf den C-Terminus des Proteins lokalisieren. Mittels eines fluoreszenzmikroskopischen Assays konnte die Bindefähigkeit von Ezrin für filamentöses Aktin (F-Aktin) in Abhängigkeit von PIP2-Bindung und Phosphorylierung quantifiziert werden. Hierbei wurde das Ausmaß der F-Aktinbindefähigkeit als direktes Maß für den Aktivierungszustand von Ezrin betrachtet. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl durch die Bindung an das Lipid PIP2 als auch durch die Phosphorylierung eine signifikante Erhöhung der ezringebundenen Menge an F-Aktin erfolgte. Erstmals konnte so bewiesen werden, dass beide Komponenten, PIP2-Bindung sowie Phosphorylierung, in einem synergistischen Prozess zu einer vollen Aktivierung des Proteins Ezrin führen. Die Bindung von Ezrin an F-Aktin konnte nur an membrangebundenem, nicht an löslichem Ezrin gefunden werden. Daraus wird geschlossen, dass die stabile Bindung von F-Aktin kooperativ über Ezrincluster erfolgt. Es konnte auf Basis der aufgenommenen Daten ein detailliertes Aktivierungsmodell erstellt werden, welches neue Einblicke in die Regulation der Verbindung von Plasmamembran und Cytoskelett bietet.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleDynamische Strukturen am Zellcortex: Aktivierbarkeit und Akkumulation von Ezrin in Abhängigkeit von PIP2de
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedDynamic structures at the cell cortex: activation and accumulation of ezrin depending on PIP2de
dc.contributor.refereeSteinem, Claudia Prof. Dr.de
dc.date.examination2011-03-18de
dc.subject.dnb500 Naturwissenschaftende
dc.description.abstractengEzrin, a member of the ezrin/radixin/moesin (ERM) protein family, acts as a membrane-cytoskeleton linker, thereby participating in a variety of cellular events. The N-terminal region of ezrin specifically binds to the lipid L-á-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) while the C-terminal region harbors a binding site for filamentous actin (F-actin). In monomeric ezrin, the respective terminal domains are tightly associated leaving ezrin in an inactive, so-called dormant state, in which the F-actin binding site is masked. Several means of regulation of ezrin s activation have been described including binding to PIP2 and phosphorylation of threonine 567 in the C-terminal domain of ezrin. To date, it is not known to what extent these two molecular factors contribute to a full activation of ezrin. The aim of this study was to design an in vitro assay that permits a detailed investigation into the processes leading to ezrin activation. In this respect, we were especially interested in identifying the relative contributions and possible synergy of PIP2 binding and phosphorylation. For that purpose, the wild type of ezrin and two mutants mimicking the unphosphorylated and the phosphorylated state, respectively, were used. Solid-supported lipid bilayers (SLB) doped with either DOGS-NTA-Ni or PIP2 allowed for specific immobilization of the proteins. Quartz crystal microbalance (QCM) experiments showed a high binding affinity in the range of 10 nM of all three proteins and very high membrane coverage. From variations of the lipid composition of the lipid membranes we inferred that ezrin binds to several PIP2 molecules. Fluorescence microscopy experiments and a detailed analysis of ezrin binding on the membrane revealed that attractive protein-protein interactions lead to protein clustering on the membrane surface. Experiments employing a C-terminally truncated version of ezrin indicate that this attractive interaction involves C-terminal domains. Fluorescence microscopy on ezrin-decorated SLBs showed that, dependent on the mode of binding and phosphorylation state, ezrin is capable of binding F-actin. A clear synergism between phosphorylation and PIP2 as binding partner of ezrin was observed suggesting a conformational switch from dormant to active state. As this interaction was only observed on planar surfaces, but not in solution, we conclude that effective F-actin binding is accomplished by cooperative binding of ezrin clusters. Based on the experimental results, a detailed activation model of ezrin is presented that provides new insights into the regulation of the membrane-cytoskeleton connection.de
dc.contributor.coRefereeAbel, Bernd Prof. Dr.de
dc.subject.topicChemistryde
dc.subject.gerEzrinde
dc.subject.gerPIP2de
dc.subject.gerF-Aktinde
dc.subject.gerCytoskelettde
dc.subject.gerQuarzmikrowaagede
dc.subject.gerFluoreszenzmikroskopiede
dc.subject.engEzrinde
dc.subject.engPIP2de
dc.subject.engF-actinde
dc.subject.engcytoskeletonde
dc.subject.engquartz crystal microbalancede
dc.subject.engfluorescence microscopyde
dc.subject.bkChemiede
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2892-2de
dc.identifier.purlwebdoc-2892de
dc.affiliation.instituteFakultät für Chemiede
dc.subject.gokfullSX 000: Biochemiede
dc.identifier.ppn664124135de


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