High-field EPR and ENDOR spectroscopy for proton-coupled electron transfer investigations in E.coli ribonucleotide reductase
Hochfeld EPR und ENDOR Untersuchungen für den Protonen gekoppelten Elektronentransfer in der E.coli Ribonukleotidreduktase
by Tomislav Argirevic
Date of Examination:2011-11-17
Date of issue:2012-02-27
Advisor:Prof. Dr. Marina Bennati
Referee:Prof. Dr. Marina Bennati
Referee:Prof. Dr. Franc Meyer
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-2052
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Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract
English
Ribonucleotide reductases (RNRs) catalyze the conversion of nucleotides to deoxynucleotides in all organisms, thereby providing the essential precursors for DNA synthesis and replication. The E.coli RNR is composed of two homodimeric subunits: alpha2 and beta2. In alpha2 nucleotides are converted to deoxynucleotides and beta2 contains a stable di-iron tyrosyl radical (Y122 ) cofactor. A proton-coupled electron transfer (PCET) mechanism is proposed to occur over a distance of more than 35 Å originating from Y122 and ending up in the generation of a C439 in alpha2 which in turn initiates the nucleotide reduction process. Three conserved redox-active tyrosines (beta2-Y356, alpha2-Y730 and alpha2-Y731) are essential for the radical transfer to Cys439 and are proposed to be connected through hydrogen- bonds during reversible charge migration over both subunits. In order to probe for structural and mechanistic requirements of a PCET event in alpha2, NH2Y has been incorporated through the suppressor tRNA/aminoacyl-tRNAsynthetase methodology at positions 730 and 731, respectively. NH2Y functions hereby as a radical spin probe on the PCET pathway and allows the elucidation of chemical environments through high-field EPR and electron-nuclear double resonance (ENDOR) spectroscopy. In order to characterize the generated 3-aminotyrosyl radical (NH2Y ) in D2O and H2O buffer, multifrequency EPR spectroscopy was first applied on NH2Y730 . The characterization of the electronic and molecular structure of a NH2Y was a crucial step in order to deconvolute the hyperfine couplings of internal protons from external protons which build up a hydrogen-bond network around alpha-NH2Y730 . High-field ENDOR spectroscopy detected two hydrogen-bonds which point into the direction of the next PCET pathway residues and additionally a water molecule which is placed near alpha-NH2Y730 and could have mechanistic functions during the proposed H-atom transfer process. A similar hydrogen-bond network was detected for alpha-NH2Y731 with a water molecule placed near the alpha/beta interface. Recent DFT calculations on the PCET mechanism in alpha2 are hereby in agreement with structural insights obtained from high-field EPR and ENDOR studies.
Keywords: ribonucleotide reductase; DNA-Synthesis; PCET; alpha2; beta2; electron transfer mechanism; high-field EPR; high-field ENDOR; multifrequency; hydrogen-bond; water molecule; 3-aminotyrosyl radical
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Ribonukleotidreduktasen (RNRs) katalysieren die Umsetzung von Nukleotiden zu Deoxynukleotiden in allen Organismen, wobei sie die wichtigen Vorläufer für die DNA-Synthese und Replikation bereitstellen. Die E.coli RNR besteht aus zwei homodimeren Untereinheiten: alpha2 und beta2. In alpha2 werden Nukleotide in Deoxynukleotide umgewandelt und beta2 stellt den stabilen zweifachen Eisen-Tyrosyl-Kofaktor bereit (Y122 ). Ein Protonen gekoppelter Elektronentransfermechanismus (PCET) wird über eine Distanz von 35 Å angenommen. Dieser Mechanismus beginnt bei Y122 und endet in der Generierung von C439 in alpha2, was die Nukleotidreduktion initiiert. Drei konservierte redox-aktive Tyrosine (beta2-Y356, alpha2-Y730 und alpha2-Y731) sind verantwortlich für den Radikaltransfer zu Cys439. Es wird angenommen, dass die redox-aktiven Aminosäuren durch Wasserstoffbrückenbindungen einen reversiblen Ladungstransfer über beide Untereinheiten ermöglichen. Um die strukturellen und mechanistischen Bedingungen für einen PCET in alpha2 zu untersuchen, wurde NH2Y durch die tRNA/aminoacyl-tRNA-Synthetase-Methode an den Positionen 730 bzw. 731 eingeführt. NH2Y dient hierbei als Radikalfänger auf dem PCET-Pfad und erlaubt die Untersuchung der chemischen Umgebung mittels Hochfeld- EPR und Elektron-Kern-Doppelresonanz-Spektroskopie (ENDOR). Um das generierte 3-Aminotyrosyl Radikal (NH2Y ) in D2O- and H2O-Puffer zu charakterisieren wurde zuerst die Multifrequenz-EPR-Spektroskopie an NH2Y730 durchgeführt. Die Charakterisierung der elektronischen und molekularen Struktur von NH2Y war ein wichtiger Schritt um die Hyperfeinwechselwirkungen der internen Protonen von denen der externen Protonen zu trennen, die das Wasserstoffbrückennetzwerk um alpha-NH2Y730 aufbauen. Mit der Hochfeld-ENDOR-Spketroskopie wurden hierbei zwei Wasserstoffbrücken detektiert, die in die Richtung der nächsten Aminosäuren auf dem PCET-Pfad zeigen. Zusätzlich wurde ein Wassermolekül detektiert, das in der Nähe von alpha-NH2Y730 sitzt und welches eine mechanistische Funktion während des H-Atom Transfers haben könnte. Ein ähnliches Wasserstoffbrückennetzwerk war für alpha-NH2Y731 detektiert worden, mit einem Wassermolekül in der Nähe der alpha/beta Grenzfläche. Kürzlich durchgeführte DFT-Rechnungen, die auf den PCET-Mechanismus in alpha2 abzielen, stehen in Übereinstimmung mit den strukturellen Erkenntnissen der Hochfeld-EPR und -ENDOR Studien.
Schlagwörter: Ribonukleotidreduktase; DNA-Synthese; PCET; alpha2; beta2; Elektronentransfermechanismus; Hochfeld-EPR; Hochfeld-ENDOR; Multifrequenz; Wasserstoffbrücken; Wassermolekül; 3-Aminotyrosyl Radikal
