Optimising His-tags for purification and phasing
Optimierte His-tags für Aufreinigung und Phasierung
Christian Groβe
Doctoral thesis
Date of Examination:
2010-10-05
Date of issue:
2011-07-26
Advisor:
Sheldrick, George M. Prof. Dr.
Referee:
Sheldrick, George M. Prof. Dr.
Referee:
Dittrich, Birger Dr.
Persistent Address: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B0A0-D
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Size:
33,3 MB
Format:
PDF
Description:
Dissertation
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Abstract
English
Rekombinant expremierte Proteine können mit einer zusätzliche Aminosäuresequenz am C- und/oder N-Terminus, dem Protein-Tag, hergestellt werden. Bei einer bestimmten Gruppe dieser Tags erlaubt die starke und spezifische Affinität des Tags gegenüber einer chromatografischen stationären Phase eine "ein Schritt Reinigung" mit minimaler Beeinflussung der biologischen Aktivität des Proteins. Andererseits sind solche Protein-Tags im Proteinkristall meist ungeordnet oder behindern die Kristallisation des Fusionsproteins. Röntgenexperimente, die Phaseninformation aus dem anomalen Signal gewinnen, erfordern aber zwingend gut geordnete anomal streuende Atome. Ein Protein-Tag der Metalionen chelatisieren kann und der gleichzeitig in der Kristallstruktur gut geordnet ist, kann die Qualität von SAD und MAD Experimenten verbessern. Als willkommener Nebeneffekt sollte die Kristallisation positiv beeinflußt werden. Wir berichten hier von synthetischen Polypeptiden, die sich als nützlich sowohl in der Metallionen-Affinitätschromatographie als auch für Phasierungsexperimente in der Makromolekülkristallographie erweisen sollten. Die chelatisierenden Eigenschaften konnten mittels Metalionen-Affinitätschromatographie nachgewiesen werden. Ihre stabile, durch Metallionen induziert Sekundärstruktur als beta-Hairpin wurde mit NMR und CD-Spektroskopie gezeigt. Fusionsproteine aus Polypeptid und MBP wurden hergestellt um IMAC-Eigenschaften und Kristallisation unter realen Bedingungen zu testen. Native Kristallstrukturen konnten bereits gelöst werden, zeigen aber teilweise entfaltete Polypeptide. Der strukturelle Einfluß von MBP auf den Tag wurde durch verschieden Linker zuntersucht.
Keywords: Kristallstruktur; Peptid; His-Tag; Phasenproblem; anomale Dispersion; IMAC; beta-Hairpin
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Several affinity protein tags consisting of short peptides or whole domains have been developed, which are included as an additive protein sequence on the C- or/and N-terminus. Their highly specific strong affinity affords a one-step purification with minimal effect on biological activity. On the other hand, protein tags are often disordered in the crystal structure and complicate protein crystallisation. Experimental phasing of macromolecules by anomalous dispersion requires well ordered atoms in the crystal lattice. A pre-organised protein tag with metal chelating properties can bind anomalous scatterers in a predefined way and enhance SAD and MAD data quality using synchrotron radiation. As a welcome side-effect such protein tags could adopt stable conformation in crystals and help the crystallisation process. Here we report polypeptides synthesised by solid phase peptide synthesis which may prove useful for both metal affinity chromatography and macromolecular phasing as well. Their chelating properties could be proved by metal ion affinity chromatography. A distinct secondary structure is induced by metal ion chelation. The beta-hairpin structure could be confirmed by circular dichroism spectroscopy and NMR. Fusion proteins made of the Maltose-binding protein fused with our polypeptides were used to check IMAC behaviour under real conditions and to validate crystal growth promotion. First crystal structures from native protein could be solved but shows partly unfolded protein tags. To separate the structural impact of the fusion protein on the tag various linker sequences were taken into account.
Schlagwörter: crystal structure; peptide; his-tag; phase problem; anomalous dispersion; IMAC; beta-hairpin
