Ultraschnelle, lichtinduzierte Primärprozesse im elektronisch angeregten Zustand des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP)

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die photophysikalischen Prozesse des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP) mittels femtosekundenzeitaufgelöster und frequenzaufgelöster spektroskopischer Methoden sowie zeitkorreliertem Einzelphotonenzählen (TCSPC) untersucht. Ziel dieser Untersuchungen war die Entwicklung eines tieferen Verständnisses der ultraschnellen Primärprozesse im angeregten Zustand des GFP. Diese Untersuchungen offenbaren nach Anregung mit ultraviolettem Licht einen relativ langsamen Protonentransfer auf einer Zeitskala von 10 ps zwischen Chromophor, Aminosäureresten und Wassermolekülen innerhalb des GFP-Gerüsts. Es zeigt sich, dass zu frühen Zeiten (bis ca. 40 ps) eine starke Korrelation der Populationen der Reaktanden- und Produktzustände vorherrscht, die nach etwa 100 ps infolge strahlungsloser Desaktivierung aufgehoben wird. Im zeitlichen Beobachtungsfenster bis in den Nanosekundenbereich wird ein multiexponentielles Zeitverhalten der Kinetiken beobachtet. Ein verallgemeinertes photophysikalisches Modell wird vorgestellt, das nichtreaktive Schwingungsrelaxationen des Chromophors einschließt, die mit dem elementaren Protonentransfer auf einer Zeitskala von ca. 20 ps konkurrieren. Darüberhinaus berücksichtigt es einen strahlungslosen Desaktivierungskanal für den angeregten Zustand, der über Torsionsbewegungen im Chromophor durch innere Konversion zurück in den Grundzustand führt. Dieses Modell reproduziert quantitativ die zeitaufgelösten Pump-Probe-Daten, die differentiellen Transmissionsspektren, die Fluoreszenzkinetiken anhand TCSPC-Experimenten, sowie die Fluoreszenzquantenausbeute von etwa 85%. Es erklärt somit die multiexponentiellen Kinetiken und den beobachteten Isotopeneffekt bei Deuterierung des GFP. Die hervorragende Übereinstimmung zwischen einer Vielzahl experimenteller Ergebnisse und dem Modell belegt die Annahme, dass der Protonentransfer von nicht-reaktivem inter- und intramolekularem Schwingungsenergietransfer sowie innerer Konversion begleitet wird. Die hier vorgestellten dynamischen Phänomene im GFP haben Modellcharakter für ultraschnelle, lichtinduzierte Primärprozesse in Proteinen.