Probing vesicle dynamics within small synapses

Abstract

Dauerhafte synaptische Transmission an der hippocampalen Synapse (Ø∼1 μm) beruht auf der Exocytose von synaptischen Vesikeln (Ø∼35 nm), welche gleichzeitig an ihre darauffolgende Endocytose gekoppelt ist. Die Kinetik dieser Prozesse werden seit längerem untersucht, jedoch weiss man nur sehr wenig über die Mobilität dieser Vesikel innerhalb der Synapse, da sie sehr klein sind und entsprechende Techniken fehlen. Fluoreszenz-Fluktuations-Spektroskopie (FFS) zur Untersuchung der Dynamik von Vesikeln in unstimulierten Synapsen wurde von Jordan (2000) eingeführt. Diese Methode wurde in der vorliegenden Arbeit durch Monte-Carlo- Simulationen ergänzt, um ein quantitatives Modell der Vesikel-Beweglichkeit vorschlagen zu können. Die Vesikel-Bewegung war langsam mit einem Diffusionskoeffizienten von 5 •10-5 μm2/s und begrenzt auf einen Käfig von ∼50 nm. Die Auswirkungen der Deaktivierung von Motor-Proteinen und der Behandlung mit Phosphatase-Inhibitoren auf die Vesikel-Beweglichkeit wurden durch Simulationen analysiert.Weiterhin ist die Entwicklung einer single particle tracking Technik beschrieben, die es erlaubt, einzelne, mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Vesikel sowohl in unstimulierten als auch stimulierten Synapsen zu untersuchen. Ein automatisierter Algorithmus identifiziert einzelne Vesikel und verfolgte ihre Bewegung in Echtzeit. Die Mobilität von verschiedenen Vesikel-Populationen wurde untersucht, welche sich durch den Endozytose-Modus unterscheiden, mit dem sie von der Plasmamembran wiederaufgenommen wurden. Die Ergebnisse des particle trackings und der FFS-Studie sind im Einklang. Die Beweglichkeit von Vesikeln konnte durch Stimulation der Synapse leicht erhöht werden.Weiterhin ist eine theoretische Studie zur Leistungsfähigkeit von Einzel-Photonen-Zählwerken mit Totzeit für die Anwendung in der single particle tracking Technik beschrieben. Ein Maximum Likelihood basierter Algorithmus wird beschrieben, der es erlaubte, die Position von einem Objekt, das kleiner als das Auflösungvermögen des Mikroskopes ist, genauer zu bestimmen als man es von der Gesamtzahl der detektierten Photonen erwarten würde.