Extracellular proteins from lignocellulose degrading Basidiomycetes: Redox enzymes from Trametes versicolor and Coprinopsis cinerea

Abstract

Das extrazelluläre Proteom bei Pilzen besteht aus drei Fraktionen: frei ins Medium ausgeschiedene Proteine, Proteine in der äußeren Schleimschicht der Hyphe und Zellwandproteine. Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von sekretierten Enzymen von holzabbauenden Basidiomyzeten einschließlich zellwandgebundenen Redox-Enzymen, insbesondere Laccasen, wurden etabliert bzw. optimiert. Bei Askomyzeten beschriebene Methoden zur Aufarbeitung von Zellwänden ließen sich bei Trametes versicolor nicht anwenden. Zerreiben von Myzel in einer Schwingmühle mit einer Stahlkugel ergab reine Zellwände ohne Kontaminationen von zytoplasmischen Enzymen. Von Zellwänden isolierte Gesamtproteine lassen sich wie Proteine aus Kulturüberständen in 1D- und 2D-Elektrophorese analysieren und die Methode der Zellwandaufreinigung lässt sich auf andere Basidiomyzeten übertragen. Generell unterscheiden sich bei T. versicolor die drei Fraktionen von sekretierten Proteinen deutlich in Ladung und Größe. Von sieben Spots in 2D-Gelen des Kulturüberstandes wurden durch ESI-LC-MS-Analyse Peroxidasen und Laccase identifiziert, 90 andere Spots blieben unidentifiziert aufgrund fehlender Sequenzdaten. In 1D- und 2D-Gelelektrophorese mit verschiedensten bekannten und neuen Substraten (allein, mit Co-Substraten und in Kombinationen) wurde das ins Medium ausgeschiedene Proteom von T. versicolor und Coprinopsis cinerea und auch das Zellwand-verbundene Proteom von T. versicolor auf Phenoloxidaseaktivitäten untersucht. Die Kombination TMA (N,N,N´,N´-Tetramethyl-1,4-phenylendiammoniumdichlorid) und alpha-Naphthol war am intensivsten im Erkennen von Phenoloxidaseaktivitäten, MBTH (3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochloridmonohydrat) mit DHPPA (3,4-Dihydroxyhydrozimtsäure) ergab die schärfsten und stabilsten Banden und Spots in Gelen. Laccasen von T. versicolor and C. cinerea konnten durch ESI-LC-MS-Analysen in Banden identifiziert werden. Laccasen in T. versicolor Zellwänden wurden durch Behandlung mit verschiedenen lytischen Enzymen aus ihnen herausgelöst, in nativer PAGE aufgetrennt, und enzymgefärbt. Durch ESI-LC-MS-Analysen von auftretenden Banden konnte Laccase III identifiziert werden neben einer Pyranoseoxidase. Laccase III ist auch in hohen Konzentrationen in Kulturüberständen von T. versicolor nach Induktion durch 2,5-Xylidin vorhanden. Aufgereinigtes Enzym wurde in seinen Eigenschaften mit denen von Zellwand-gebundenen Laccaseaktivität verglichen. pH-Optima waren unterschiedlich und Stabilitäten in hohen Temperaturen und gegenüber Enzyminhibitoren sind bei gebundenen Enzymen besser.