Hydrophobins in wood biology and biotechnology

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle von Hydrophobinen beim Holzabbau und ihre Fähigkeit, Oberflächen insbesondere Holzoberflächen - zu beschichten, zu untersuchen. Hydrophobine sind kleine amphipatische pilzliche Proteine, die dafür bekannt sind, die Oberflächenspannung von feuchten Oberflächen zu vermindern (Wasser/Luft-Grenzflächen), die Bildung von Lufthyphen durch Beschichtung mit einem hydrophoben Proteinfilm zu erleichtern und das Anhaften von pilzlichen Hyphen an hydrophobes Material zu unterstützen. Das SC3-Hydrophobin von Schizophyllum commune ist bisher das bestuntersuchte Klasse I-Hydrophobin. Ein weiteres Protein, SC15, unterstützt SC3 bei der Bildung von Lufthyphen und ihrer Anheftung an Oberflächen. In Abwesenheit des SC3-Hydrophobins verleiht es Hyphen eine geringe Hydrophobizität. Da von dem Weißfäulepilz S. commune SC3- und SC15-Hydrophobin-Mutanten existieren, wurde diese Art ausgewählt, um die Funktion dieser Proteine bei Holzbesiedelung und -abbau zu untersuchen. Versuche mit Holzblöcken und Sägemehl mit verschiedenen S. commune-Stämmen haben gezeigt, dass sowohl pilzliche Mono- als auch Dikaryen - einschließlich co-isogenen Wildtyp-Stämmen, ΔSc3-Mutanten, ΔSc15-Mutanten und ΔSc3-ΔSc15-Doppelmutanten - auf Buchen-, Birken- und Kiefernholz wachsen konnten. Die Ergebnisse zeigen, dass weder SC3 noch SC15 notwendig sind, damit S. commune in das Holz eindringen, das Holz abbauen und die Holzfestigkeit beeinflussen kann. Allerdings unterschied sich das Ausmaß der Myzelbildung an der Holzoberfläche in Abhängigkeit vom Vorhandensein von SC3-Hydrophobin. Meistens war der Holzabbau durch die Pilzstämme gering (Laubholz) oder fand nicht statt (Kiefernholz). Bei den Versuchen mit Holzblöcken und Sägemehl betrug der maximale Abbau durch S. commune-Stämme 4-5% (Buche und Birke) bzw. 9-16% (Buche und Kiefer). S. commune-Stämme entfärbten das Kiefernsägemehl, nicht aber das Buchen- und Birkensägemehl. Obwohl die Holzblöcke nur geringfügig oder gar nicht abgebaut wurden, wurde die Holz festigkeit negativ durch die S. commune-Stämme beeinflusst. Der maximale Festigkeitsverlust durch S. commune-Stämme betrug bei Buche, Birke bzw. Kiefer 21, 52 bzw. 35%.S. commune ist ein opportunistischer Krankheitserreger von geschwächten Bäumen. Die Besiedelung eines Juglans ailantifolia-Baumes durch den Pilz wurde während einer Zeitspanne von drei Jahren beobachtet. Der Pilz verursachte während dieser Zeit das Absterben mehrerer Äste. An mindestens einem Ast war S. commune nicht der einzige Pilz. Neben Fruchtkörpern von S. commune wurden solche von Trametes hirsuta gefunden. Beide Pilze wurden von diesem Baum isoliert und ihre Interaktion untersucht.Interaktionsuntersuchungen von S. commune und T. hirsuta resultierten im Deadlock -Phänomen, bei dem sich eine Grenzzone zwischen den Pilzstämmen bildet, in der das Weiterwachstum der Opponenten verhindert wird. Mit fortschreitender Zeit verdrängte T. hirsuta S. commune. Als Stressreaktion während der Konkurrenzsituation war eine blaue Pigmentierung an der pilzlichen Interaktionszone zu beobachten. Alle S. commune-Stämme (monokaryotische und dikaryotische Wildtyp-Stämme und monokaryotische Hydrophobin-Mutanten) außer der dikaryotischen SC3-Hydrophobin-Mutante bildeten die Grenzzone und Pigmentierung in der Interaktionszone aus. Dies deutet darauf hin, dass das SC3-Hydrophobin nicht essentiell an der Stressreaktion von S. commune beteiligt ist.Protein- und Polysaccharid-Produktion eines S. commune-Wildtyp-Stamms und einer co-isogenen Hydrophobin-Mutante in Flüssigkultur wurden verglichen. In Flüssigkultur wurde mittels FTIR-(Fourier-Transform-Infrarot)-Spektroskopie festgestellt, dass sich die Protein- und Polysaccharidgehalte im Myzel des Wildtyps und der Hydrophobin-Mutante signifikant unterscheiden. Der Proteingehalt des Wildtyps war höher als der in der Mutante, während der Polysaccharidgehalt der Mutante mit der Zeit höher war. Myzel von verschiedenen Wildtyp-Stämmen und co-isogenen Mutanten, das auf der Oberfläche von Buchenholz gewachsen war, wurde durch Clusteranalyse von FTIR-Spektren voneinander unterschieden. FTIR-Spektren von Myzel verschiedener Wildtyp-Stämme und co-isogener Mutanten, das im Holz gewachsen war, bildeten einen gemeinsamen Cluster. Die Flächen der Protein- Peaks der untersuchten Stämme unterschieden sich auf der Holzoberfläche nicht signifikant voneinander. Die Flächen der Polysaccharid- Peaks der dikaryotischen SC3-Hydrophobin-Mutante ΔSc3 4-39 x ΔSc3 4-40 waren auf der Holzoberfläche hingegen signifikant höher als die der monokaryotischen Mutanten ΔSc3 4-39 und ΔSc3 4-40.Das SC3-Hydrophobin von S. commune wurde aus dem Pilzmyzel mit einem Ertrag von 0.1 % (w/w, 0.5 mg an SC3-Hydrophobin aus 500 mg Myzel) aufgereinigt und zum Beschichten von hydrophobem und hydrophilem Material verwendet. Hydrophobes Teflon und Formwar-Filme wurden hydrophil und hydrophiles Glas wurde hydrophob nach Beschichtung mit SC3-Hydrophobin. Weiter wurden die amphipatischen Eigenschaften von Proteinfilmen auf Buchenholz getestet. Buchenholz wurde in Abhängigkeit von der verwendeten SC3-Konzentration hydrophil oder hydrophob. Niedrige SC3-Konzentrationen (50, 25, 15 µg/ml) bewirkten Hydrophobie und hohe Konzentrationen (100 bis 400 µg/ml) Hydrophilie bei Buchenholz. Oberflächen-Aktivitäten weiterer Klasse I-Hydrophobine von anderen Pilzarten wurden an Buchenholz untersucht. Circa 0,3 bis 0,1% (w/w) Hydrophobin ließ sich aus Myzel von Coprinopsis cinerea und Pleurotus ostreatus-Kulturen aufreinigen. Die Hydrophobine dieser beiden Pilze wiesen die gleichen Eigenschaften bezüglich der Oberflächenaktivität auf Holz auf wie das SC3-Hydrophobin. ATR-FTIR-(Abgeschwächte Totalreflexions-Fourier Transform Infrarot)-Spektren von mit Hydrophobin behandeltem Holz zeigten eine höhere Peak-Intensität in dem Spektralbereich, der der Amid I-Bande von Proteinen zugeschriebenen wird, als unbehandeltes Holz, was für die Bindung der Hydrophobine an Holzkomponenten spricht.