Laccases and other ligninolytic enzymes of the basidiomycetes Coprinopsis cinerea and Pleurotus ostreatus
submerged and solid state fermentation, morphological studies of liquid cultures and characterisation of new laccases
Laccasen und andere ligninolytische Enzyme der Basidiomyceten Coprinopsis cinerea und Pleurotus ostreatus
Submers- und Feststofffermentation, Morphologische Studien von Flüssigkulturen und Charakterisierung von neuen Laccasen
by Martin Rühl
Date of Examination:2009-09-18
Date of issue:2009-12-23
Advisor:Prof. Dr. Ursula Kües
Referee:Prof. Dr. Ursula Kües
Referee:Prof. Dr. Stefan Schütz
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-2296
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Description:Dissertation
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Abstract
English
Organisms produce ligninolytic enzymes in order to degrade lignocellulosic materials. Mainly, such enzymes are found in the fungal kingdom and are particularly widespread in the phylum Basidiomycota. The ligninolytic system of fungi consists of peroxidases (manganese peroxidases - MnP, lignin peroxidases - LiP and versatile peroxidases - VP) and laccases which for substrate degradation are secreted by the fungus into the environment. Laccases as main representative of the ligninolytic system can be used for delignification and bleaching in the pulp and paper industry, in the production of wood composites and to alter wood properties. As production and biochemical characterisations of laccases are in the focus of this PhD thesis, the question of how to produce large and stable amounts of this enzyme was a driving force for the studies. Laccases and other ligninolytic enzymes can be produced by cultivating adequate fungi either in submerged fermentation (SmF) or solid state fermentation (SSF). A short introduction to both fermentation techniques is presented in the study with regard to enzymes which are relevant for the wood processing industry.As an example for SSF, the production of ligninolytic enzymes of the white-rot fungus Pleurotus ostreatus during cultivation on wheat straw was experimentally studied. In comparison to SSF, SmF is easier to handle, better reproducible and normally used in industrial production of fungal enzymes and other metabolites. Therefore in this thesis, SmF is discussed in more detail. In liquid cultures during SmF, filamentous fungi can grow in free filamentous or in aggregated forms, known as pellets. The fungus used for liquid cultivation in this PhD thesis, the basidiomycete Coprinopsis cinerea, grew in a pellet like form in all tested liquid fermentation systems (shaken flasks, bioreactor). The study contains detailed analyses of the morphology of C. cinerea in SmF, which give an overview on the influence of different cultivation parameters (pH, temperature, fermentation system) on the growth type of C. cinerea. To analyse native production of laccases in C. cinerea, ten different monokaryotic strains of this fungus were tested and the isoenzyme patterns of the highest laccase producers were analysed. Further experiments were conducted for recombinant production of a single laccase isoenzyme in C. cinerea and to improve the recombinant production of laccase by cultivation parameters. Thereby, in addition to the already known C. cinerea laccase Lcc1, three C. cinerea laccases (Lcc5, Lcc6 and Lcc7) could be produced in bigger amounts. The so produced laccases were purified and characterised according to molecular and biochemical aspects. Thus, a broad picture is given in this thesis starting from the cultivation of basidiomycetes in either SmF or SSF, the production of native and recombinant laccases and their characterisation.
Keywords: laccase; Coprinopsis cinerea; filamentous fungi; fermentation
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Ligninolytische Enzyme werden von Mikroorganismen produziert mit dem Zweck, Lignocellulose abzubauen. Verschiedene ligninolytische Enzyme, wie Peroxidasen (Mangan-Peroxidasen - MnP, Lignin-Peroxidasen - LiP und versatile-Peroxidasen - VP) und Laccasen werden überwiegend von Pilzen, insbesondere Basidiomyceten zum Substratabbau in ihre Umgebung sekretiert. Laccasen als eine der wichtigsten Enzymklassen im ligninolytischen System von Pilzen werden in der Industrie zum Delignifizieren und Bleichen von Papier und Pülpe, zur Herstellung von Holzwerkstoffen und zur Veredelung von Hölzern eingesetzt. Die Produktion von Laccasen und deren biochemische Charakterisierung stehen daher im Fokus dieser Doktorarbeit. Laccasen und andere ligninolytische Enzyme können industriell durch Kultivierung von entsprechenden Pilzen sowohl in submersen Fermentationsverfahren (SmF) als auch in Feststofffermentationen (SSF) hergestellt werden. Zu Beginn dieser Arbeit werden beide Fermentationssysteme ! dargestellt und ihr Einsatz bei der Produktion von Enzymen diskutiert. Die Produktion von ligninolytischen Enzymen in SSF wurde beispielhaft am Weißfäulepilz Pleurotus ostreatus untersucht. Da SmF im Gegensatz zu SSF einfacher zu handhaben sind, eine bessere Reproduzierbarkeit aufweisen und standardmäßig in der industriellen Produktion von pilzlichen Enzymen und anderen Metaboliten eingesetzt werden, wird diese Art der Kultivierung in der Doktorarbeit detaillierter behandelt. Filamentöse Pilze können in solchen Flüssigkulturen entweder als freie Filamente oder als Hyphenaggregate, sog. Pellets, wachsen. Der in der Arbeit verwendete Basidiomycet Coprinopsis cincerea wuchs in den beiden getesteten Systemen (Schüttelkolben, Bioreaktor) in Form von Pellets. Eine detaillierte Darstellung der Untersuchungen zur Morphologie von C. cinerea in SmF bietet einen Einblick in die Einflüsse von Kultivierungsparametern (pH, Temperatur, Kultivierungssystem) auf dessen Wachstumsverhalten. Zur nativen Produktion von Laccasen wurden verschiedene C. cinerea Stämme in SmF kultiviert und die Isoenzymmuster der höchsten Produzenten analysiert. Weitere Experimente wurden durchgeführt, um einzelne Laccasen rekombinant in C. cinerea zu produzieren und deren Produktionsrate zu erhöhen. Dabei konnten neben der schon bekannten C. cinerea Laccase Lcc1 drei weitere C. cinerea Laccasen (Lcc1, Lcc5, Lcc6 und Lcc7) rekombinant in größeren Mengen produziert werden. Alle so produzierten Laccasen wurden aufgereinigt und hinsichtlich molekularer und biochemischer Aspekte charakterisiert. Somit gibt diese Arbeit ein umfassendes Bild von der Kultivierung zweier Basidiomyceten in SmF oder SSF, über die Produktion von nativen und rekombinanten Laccasen bis hin zu dessen Charakterisierung.
Schlagwörter: Laccase; Coprinopsis cinerea; filamentöse Pilze; Fermentation