Actions of lignocellulolytic enzymes on Abies grandis(grand fir) wood for application in biofuel production

Abstract

Abies grandis ist ein schnell wachsender Nadelbaum, der großes Potential in der nachhaltigen Holzproduktion und deren verarbeitetenden Industrie besitzt. Daher ist es für mögliche Anwendungen notwendig, mehr über das Verhalten von A. grandis Holz gegenüber holzabbauenden Pilzen zu erfahren. In Abbauversuchen nach Norm EN 113 (1996) konnten sowohl Holz als auch Holzprodukte von A. grandis durch Braunfäulepilze abgebaut werden, aber gegenüber Weißfäulepilzen zeigten A. grandis Holz eine vergleichsweise gute Resistenz. Früh- und Spätholz von A. grandis wurde in unterschiedlicher Stärke über die Inkubationszeit abgebaut. Nach 19 Wochen zeigten die vom Braunfäulepilz Corniophora puteana besiedelten Früh- und Spätholzproben einen höheren Gewichtsverlust als die Frühholzproben. Im Gegensatz dazu verursachte der Weißfäulepilz Trametes versicolor einen 2mal höheren Gewichtsverlust bei Frühholzproben im Vergleich zu Früh- und Spätholzproben. Behandlung mit Harnstoffformaldehyd oder Ammoniumsulfat steigerte die Beständigkeit des Holzes gegenüber Weißfäulepilzen. Wasser- und Aceton-extrahiertes Holz verlor dagegen an Resistenz- rissiges Holz war darüber hinaus auch anfälliger; wahrscheinlich erlauben Risse Pilzen einen leichten Eintritt ins Holz. Es wurde angenommen, dass Weißfäulepilze oxidative Enzyme (Laccasen, Peroxidasen) sekretieren, um das in den Holzzellwänden vorkommende Lignin zu modifizieren. Diese Modifikation des Lignins resultiert in Chinonstrukturen, die mit MBTH (3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon Hydrochlorid Monohydrat) gefärbt werden kön-nen, worauf eine rötliche Farbe entsteht. Die Effekte der oxidativen Enzyme auf Holzzellwände wurde untersucht, in dem Holzschnitte mit MBTH inkubiert wurden. Rötliche Färbung der Holzzellwand deutete dabei auf modifiziertes Lignin in der Holzzellwand hin. Die Dicke der Zellwand und deren Färbung verringerten sich durch längere Inkubation mit T. versicolor, wahrscheinlich durch starken Ligninabbau. Inner-halb von Jahrringen nahm der Anteil des gefärbten Zellwandbereichs (AS) und der gesamte Zellwandbereich (AT) in einer s-förmigen Kurvenform vom Früh- zum Spätholz zu. Um den Angriff der Pilze auf das Lignin zu simulieren, wurde das RedOx-Enzym Laccase mit Mediator (HBT: 1-Hydroxybenzotriazol, HBA: 4 Hydroxybenzoesäure; beide Substanzen reagieren nach Oxidation durch Laccase mit Lignin) oder Mn3+-Ace-tat als ein mit Lignin reagierendes Produkt der pilzlichen Manganperoxidase in A. grandis Vollholz injiziert. Die rötliche Färbung mit MBTH war etwas besser mit Laccase mit HBT als mit HBA. Auch die Inkubation mit Mn3+-Acetat ergab eine rötliche Färbung der Holzzellwände, wobei die stärkste Färbung bei der höheren Mn3+-Acetat Konzentration von 10 mM auftrat. Die Weißfäulepilze Pleurotus ostreatus und T. versicolor zählen zu den besten Laccaseproduzenten bei Zugabe von A. grandis Holz als Laccaseinduktor zu Pilzkultu-ren. Holz und Holzextrakstoffe induzierten in Abhängigkeit von Konzentration die Produktion von extrazellulären Laccasen, aber nicht von anderen lignozellulolytischen Pilzenzymen, wie Manganperoxidase (MnP), Ligninperoxidase (LiP) oder Zellulasen als Enzyme, die ebenfalls mit Lignocellulose reagieren. Aus Kultivierungsversuchen der Pilze in Medium mit Holz und unterschiedlichen C und N Gehalten läßt sich folgern, dass das C/N Verhältnis des Holzes ein weiterer genereller Faktor in der Laccase-induktion ist. Holzextraktstoffe von A. grandis zeigten inhibierende Wirkung auf das Wachs-tum der Weißfäulepilze Coprinopsis cinerea, P. ostreatus und T. versicolor. Die extra-hier¬baren Holzstoffe wurden mittels Gaschromatographie und Massenspektro¬metrie (GC-MS) identifiziert. In den Wasser- und den Acetonextrakten wurden neun verschie-de¬ne phenolische Stoffe gefunden: 2-Methoxyphenol (Guajacol), 4-Hydroxybenzaldehyd, 1,4-Dihydroxybenzen (Hydrochinon), 3,5-Di-tertbut-4-hydroxytoluol (Butylhydroxytoluol), 3-Methoxy-4-hydroxybenzaldehyd (Vanillin), 4-Hydroxybenzoesäure, 3-Methoxy-4-hydroxybenzoesäure (Vanillinsäure), 4-Hydroxy-zimtsäure (p-Cumarin-säure) und 4-Hydroxy-3-methoxyzimtsäure (Ferulasäure). Einige der natürlichen phe-nolischen Stoffe, wie 4-Hydroxyzimtsäure, 4-Hydroxybenzaldehyd oder 3,5-Di-tertbut-4-hydroxytoluol können als natürliche Induktoren in der Laccaseproduktion mit P. ostreatus und T. versicolor eingesetzt werden. Allerdings hemmte die Zugabe von 1,4-Dihydroxybenzen und p-Benzochinon zu den Flüssigkulturen in der Konzentration von 1 mM das Wachstum von P. ostreatus und T. versicolor. Durch Holyextrakstoffe in der Produktion induzierte Lasseisoenyzme der beiden Pilze wurden mittels nativer Gelelektrophorese analysiert und mittels MS-Analyse der proteolytisch verdauten Proteine indentifiziert. Im Fall von P. ostreatus wurde das Isoenzym Laccase II und im Fall von T. versicolor die Isoenzyme Laccase I und Laccase III gefunden. Weiterhin wurde A. grandis Holz für den technischen Einsatz in der enzymati-schen Biokraftstoffherstellung getestet. Dabei konzentrierten sich die Experimente auf chemische, physikalisch-chemische und biologische Vorbehandlungen des Holzes und auf die Hydrolyse von Zellulose durch Zellulasen, die entweder allein oder in Kombina-tion mit anderen Enzymen (Xylanase, Laccase oder β-Glukosidase) eingesetzt wurden, um eine hohe Ausbeute an Glukose aus dem lignozellulosehaltigen Substrat für die Bio-kraftstoffherstellung zu erhalten. In biologischen Vorbehandlungen wurden kleine A. grandis Holzblöcke für 19 Wochen nach der Norm EN 113 (1996) mit Pilzen inku-biert. Die biologische Vorbehandlung mit P. ostreatus (im Vergleich zu T. versicolor und C. puteana) ergab exzellente Raten von 42,8% für die Umsetzung der gesamten Holzmasse in Glukose, was 92,4% der im A. grandis Holz verfügbaren Zellulose entspricht. Eine energieaufwendigere Vorbehandlung unter Einsatz von 8 ml einer 85%igen Phosphorsäure für 1 h bei 50oC resultierte ebenfalls in guten Glukoseausbeuten bei An-wendung von jeweils 4 U ml-1 Zellulase, Xylanase und Laccase. Längere Inkubations-zeiten und höhere Konzentrationen und Mengen an Phosphorsäure bei einer Inkuba-tionstemperatur von 50oC führten zu Gewichtsverlusten von bis zu 50% bei gleichzei-tiger Steigerung des Zelluloseanteils auf bis zu 100%. Höchste Glukoseausbeuten (bis zu 100%) konnten durch eine physikalisch-chemische Vorbehandlung erzielt werden, bei der 1 g Holzpartikel in 8 ml einer 85%igen bzw. 80%igen Phosphorsäure für 20 sec in einer Mikrowelle erhitzt wurde, und eine anschließende Hydrolyse mit einer Mi-schung aus 4 U ml-1 Zellulase, 4 U ml-1 Xylanase und 4 U ml-1 Laccase oder, alternativ zur Laccase, 4 U ml-1 β-Glukosidase für 24 h in 5 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5.0. Die Mikrowellenbehandlung erlaubte eine Reduzierung der Phosphoräurekon-zentration unter 80% bis hin zu 40% und 20% mit noch annehmbaren Zuckerausbeuten in nachfolgender enyzmatischer Hydrolose der Zellulose (60% Umwandlung von Zellulose in Glukose), aber nur, wenn Zellulase und Xylanase zusammen mit Laccase eingesetzt wurden. Wasserextrakte aus Holz, bzw. spezifische phenolische Substanzen (p-Cumarinsäure, Vanillinsäure und Ferulasäure) in den Extrakten, zeigten inhibierende Wirkung bei der Hydrolyse von Zellulose mit Zellulase. Phenolische Stoffe in den Holzextrakstoffen können durch Laccaseaktivität abgebaut werden, was einen höheren Umsatz der Zellulasen in der Glukoseproduktion gewährleistet und was den positiven Effekt der Laccase auf die Glukoseproduktion aus Zellulose von A. grandis Holz erklärt.