Isolierung von DNA aus rohem und bearbeitetem Holz von Dipterocarpaceen

Abstract

Entwaldung stellt die hauptsächliche Bedrohung der globalen biologischen Vielfalt dar und verursacht erhebliche Umweltzerstörung insbesondere in den Tropenregionen, die die höchste Artendichte beherbergen. Ein Drittel der weltweiten Entwaldung ist durch Holzeinschlag bedingt, der zu über 50% illegal erfolgt (Brack, 2003). Bei den Dipterocarpaceen handelt es sich um eine artenreiche Familie von Bäumen, die im tropischen Gürtel auf den Kontinenten Südamerika, Afrika und Asien beheimatet ist. Die Dipterocarpaceen werden häufig auf Tropenholzmärkten gehandelt und nehmen somit eine bedeutende Stellung in der Wirtschaft vieler südostasiatischer Staaten ein. In vielen Regionen sind die Dipterocarpaceen jedoch erheblich gefährdet aufgrund von Entwaldung und nicht nachhaltiger Bewirtschaftung. Gegen den illegalen Holzeinschlag wurden viele Maßnahmen von Regierungs- und Nichtregierungsorganisationen ergriffen. Einige Verbände der Holzindustrie haben Richtlinien erlassen,! die ihre Mitglieder verpflichten, nur Holz aus legaler und nachhaltiger Wirtschaft zu beziehen. Hieraus ergibt sich die Notwendigkeit, Werkzeuge zu entwickeln, die die Bestimmung der Herkunft des Holzes ermöglichen und damit die Prüfung der Glaubwürdigkeit von Herkunftsbescheinigungen erlauben. Methoden der molekularen Genetik erweisen sich als nützlich, die Identität einer Art zu bestätigen und sind vielversprechende Werkzeuge der Bestimmung der geographischen Herkunft des geschlagenen Holzes. Zur Anwendung des molekulargenetischen Ansatzes müssen zwei Bedingungen erfüllt sein: Zum Einen müssen Protokolle zur Isolierung von DNA in hinreichender Menge und Qualität aus rohem oder bearbeitetem Holz entwickelt werden. Zum Zweiten sind diagnostische DNA-Marker zu identifizieren, die eine hohe räumliche Auflösung aufweisen müssen. Das Ziel dieser Arbeit ist die Etablierung von Methoden der DNA Extraktion für das Holz der Dipterocarpaceae. Zum Beginn dieser Arbei! t wurden mehrere veröffentlichte Methoden der DNA Isolierung ! sowie k ommerzielle Extraktionskits an verschiedenen Proben von rohem und bearbeitetem Holz untersucht. Die Extrakte wurden mittels PCR analysiert, um den Erfolg der Extraktion nachzuweisen. Die optimierte DNeasy Plant mini Kit (Qiagen) Methode (Rachmayanti et al., 2006) wird als die effizienteste Methode angesehen. Diese Methode überzeugt durch den kleinen Maßstab und die Anwendbarkeit in einem standardmäßig ausgestatten Genlabor. Nichtsdestotrotz erbringt sie eine hinreichende Menge und Qualität für PCR Amplifizierung und weitere nachfolgende Methoden wie DNA Genotypisierung, Klonierung und Sequenzierung. Die Zugabe von Polyvinylpyrrolidon (PVP) zum Lysepuffer ist wichtiger Bestandteil dieser Methode, da hierdurch die Hemmung der PCR signifikant vermindert werden kann. Holzproben unterschiedlicher Arten, Typen (roh und bearbeitet), geographischer Herkunft und Zustand wurden in dieser Arbeit untersucht. Insgesamt 406 Proben, bestehend aus 332 Proben von Dipterocarpaceae und ! 74 von anderen Holzarten wurden analysiert. Eine Untersuchung mit Chloroplasten-DNA-Marker zeigte erfolgreiche Amplifizierung in 369 von 406 PCR Experimenten (90,9%) beim kurzen Fragment (ccmp2, etwa 150 bp), 319 von 406 PCR Experimenten (76,6%) beim mittellangen Fragment (trnL, etwa 600 bp) und 234 von 406 PCR Experimenten (57,6%) beim langen Fragment (trnLF, etwa 1,100 bp). Der durchschnittliche Erfolg für die drei Fragmente lag bei 75,7%. Insgesamt 18 Holzproben aus Indonesien mit Querschnittsdurchmessern von 19,0 bis 32,0 cm wurden vergleichend untersucht hinsichlich der DNA Menge und Qualität in Extrakten der verschiedenen Zonen des Holzes: Splintholz (a), Übergangszone von Splint- zu Kernholz (m) und Kernholz (i). Das Ergebnis zeigt, daß: 1) Die DNA Menge im Verlauf vom Kernholz zum Splintholz zunimmt. 2) Das Ausmaß des Zerfalls der DNA vom Splintholz zum Kernholz größer wird. 3) Der Gehalt an PCR Hemmstoffen vom Kernholz zum Splintholz zunimmt.