Zur Kurzanzeige

Etablierung eines Plasmid-basierten Testsystems zur funktionellen Messung der zellulären Doppelstrangbruch-Reparaturfähigkeit in hämatopoetischen Zellen

dc.contributor.advisorEmmert, Steffen Prof. Dr.de
dc.contributor.authorHermann, Juliade
dc.date.accessioned2012-04-16T17:24:56Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:24Zde
dc.date.issued2011-03-04de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B1BD-7de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-959
dc.description.abstractVeränderungen und Mängel in der individuellen Reparaturkapazität scheinen an der Entstehung der therapieassoziierten akuten myeloischen Leukämie (t-AML) beteiligt zu sein. Polymorphismusstudien deuten an, dass zwischen de-novo- und t-AML ein Unterschied in den verschiedenen Reparatursystemen besteht. Diese Beobachtungen lassen jedoch keine Schlüsse auf die funktionellen Unterschiede zu. Insbesondere Doppelstrangbrüche werden als kritische Primärläsion für die Entstehung von Translokationen angesehen, welche ein typisches Merkmal von Leukämien sind. Ziel dieser Arbeit war daher die Etablierung eines modifizierten Wirtszell-Aktivierungs-Tests zur funktionellen Messung der individuellen zellulären Doppelstrangbruch (DSB)-Reparaturkapazität. In unserem Testsystem wurde das Plasmid pCMVluc durch ein Enzym im Luciferasegen-tragenden Abschnitt einmalig mit glatten Enden geschnitten und mittels Gelelution aufgereinigt. Anschließend wurde das linearisierte Plasmid in Leukämie- respektive primäre Blutzellen von Patienten transfiziert, um deren funktionelle Reparaturkapazität zu untersuchen. Nur durch eine funktionierende korrekte DSB-Reparatur in der Zelle ließ sich das Plasmid so religieren, dass das pCMVluc- Gen abgelesen werden und Luciferase gebildet werden konnte. Dieses wurde durch die Lichtemission als lineare Korrelation der Luciferasemenge detektiert. Diese Methode wurde dahingehend optimiert, dass sie in primären Blutlymphozyten funktioniert und für die Analyse der DSB-Reparatur neu etabliert. Zudem wurde gezeigt, dass die AML-Zelllinie Kasumi-1 und die B-Zell-Lymphom-Zelllinie SU-DHL-4 eine signifikant verminderte DSB-Reparaturkapazität gegenüber den Kontrollzelllinien GM 03715 und AG 10107 aufweisen (6,44 % ± 0,75 %, 4,44 % ± 0,33 % versus 27,35 % ± 1,13 % und 10,79 % ± 0,71%). Demgegenüber waren die Reparaturkapazitäten der T-Zell-Leukämie-Zelllinie CCRF-CEM und der CML-Zelllinie K562 nicht erniedrigt (20,47 % ± 1,64 % und 26,66 % ± 1,25 %). Das in dieser Arbeit etablierte Wirtszellreaktivierungs-Testsystem ist für die Untersuchung der funktionellen Zusammenhänge zwischen (t-)AML-Leukämogenese und veränderter DSB-Reparaturkapazität geeignet. Außerdem besteht potentiell die Möglichkeit der Bestimmung der individuellen Reparaturkapazität eines Patienten vor einer geplanten Chemotherapie, um optimiertes Behandlungskonzept für Hochrisikopatienten hinsichtlich der Verminderung des Auftretens von t-AML zu entwickeln.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleEtablierung eines Plasmid-basierten Testsystems zur funktionellen Messung der zellulären Doppelstrangbruch-Reparaturfähigkeit in hämatopoetischen Zellende
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedfunctional double-strand-break repair analysis in haematopoietic cellsde
dc.contributor.refereeEmmert, Steffen Prof. Dr.de
dc.date.examination2011-03-08de
dc.subject.dnb610 Medizin, Gesundheitde
dc.description.abstractengAlterations and deficiencies in individual DNA repair systems seem to be involved in the development of therapy-related myeloid leukemia (t-AML). Studies of polymorphisms suggest differences in double-strand break repair between de-novo-AML and t-AML. But these findings don t allow conclusions from the functional status. Double strand breaks are regarded as the critical primary lesion for the development of genetic translocations, a typical feature seen in leukemia. The present paper deals with the functional measurement of doubles strand break repair using host cell reactivation. pCMVluc, a plasmide coding for luciferase-enzyme, was cut within the gene coding region via restriction enzyme digestion producing blunt ends. After agarose gel purification the linearized plasmid DNA was transfected into leukemic and lymphocyte cell lines to measure the functional repair capacity. Luciferase enzyme would only be synthesized in case of a correctly working double strand break repair detected by luminescence. The host cell reactivation assay was optimized for using primary blood lymphocytes as well as for analyzing double strand break repair. Kasumi-1-cells isolated from a patient with AML as well as SU-DHL-4 lymphoma cells had a significantly lower double-strand break repair capacity compared to normal lymphocytes GM 03715 and AG 10107 (6,44 % ± 0,75 %, 4,44 % ± 0,33 % versus 27,35 % ± 1,13 % and 10,79 % ± 0,71%). Repair capacity of CCRF-CEM (a T-cell leukaemia cell line) and K562 (chronic myeloid leukaemia cell line) is not reduced (20,47 % ± 1,64 % und 26,66 % ± 1,25). Thus, the applied, modified host cell reactivation assay can be used for functional dounle strand break repair analysis to elucidate the role of DNA-repair in (t-)AML-leukaemogenesis. A future trend would be to determine the individual susceptibility to t-AML prior to chemotherapie in order to optimize treatment concepts.de
dc.contributor.coRefereeBurfeind, Peter Prof. Dr.de
dc.subject.topicMedicinede
dc.subject.gerDoppelstrangbruchreparaturde
dc.subject.gerHCRde
dc.subject.gerAMLde
dc.subject.gert-AMLde
dc.subject.gerLuciferasede
dc.subject.gerTransfektionde
dc.subject.engdouble-strand-break repairde
dc.subject.engHCRde
dc.subject.engAMLde
dc.subject.engt-AMLde
dc.subject.engluciferasesde
dc.subject.engtransfectionde
dc.subject.bk44.81de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2862-2de
dc.identifier.purlwebdoc-2862de
dc.affiliation.instituteMedizinische Fakultätde
dc.subject.gokfullMED 424: Onkologiede
dc.identifier.ppn66420757Xde


Dateien

Thumbnail

Das Dokument erscheint in:

Zur Kurzanzeige