Analyse prognostischer Faktoren für die TNFα Antagonisten-Therapie bei Rheumatoider Arthritis

Abstract

Bei der Rheumatoiden Arthritis (RA) steht das proinflammatorische Zytokin TNFα pathogenetisch im Mittelpunkt und führt zu Schmerz, Entzündung und Gelenkszerstörung. Der Auslöser bzw. das auslösende Antigen für den als autoimmun geltenden chronisch-entzündlichen Prozess ist bislang unbekannt. TNFα wird im Rahmen einer Biologika- Therapie mit dem löslichen, rekombinanten TNF-α Rezeptor/IgG Fc Fusionsprotein Etanercept im Serum gebunden und somit an seiner biologischen Wirkung gehindert. Die bei der RA überaktive Entzündungskaskade kann seit der Einführung der Therapie mit sogenannten biologicals wie z.B. Etanercept unterbrochen werden. Bei 60-70 % der Behandelten (responder) kommt durch Schmerzrückgang und der Verhinderung weiterer Knochenzerstörung zu Prognosebesserung. Jedoch tritt bei etwa 20-40 % der Patienten ein Therapieversagen auf. Um für diese non-responder die nicht auf die TNFα- Blockade Therapie ansprechen statt der nebenwirkungsreichen und teuren Therapie ein besseres Behandlungskonzept bereithalten zu können, bedarf es der Identifikation eines prognostischen Biomarkers. Dieser Serum- Biomarker soll ein Ansprechen oder Nicht-Ansprechen auf die Therapie individuell vorhersagen können. Zur Identifikation valider Prädiktoren für ein Therapieansprechen/-versagen wurde in der aktuellen Studie eine Serum- Proteomanalytik bei RA-Patienten durchgeführt, die eine Therapie mit Etanercept erhielten. Das Proteom ist eine Momentaufnahme der aktuellen Proteinexpression. Das Proteom ist dem Genom und Translatom nachgeschaltet und unterliegt den Einflüssen externer Stimuli, Erkrankungen oder Medikamenten. Das Proteom bietet durch Dynamik und Variabilität bezogen auf zahlreiche posttranslationale Modifikationen (z.B. Glykosylierung, Citrullinierung) ein vielversprechendes Analysefenster. Den Studiendesign folgend erfolgte eine Serum- Entnahme von RA Patienten für die Proteomics- Analysen vor der Therapie (V0) und nach 24 Wochen (V6). Zu diesen Terminen sowie in Woche 4, 8 und 12 erfolgte parallel zur Etanercept- Therapie eine klinische Untersuchung zur Erhebung der Krankheitsaktivität (DAS28-score) sowie eine laborchemische Untersuchung (BSG, CRP, RF, anti-CCP). Die Klassifizierung als responder oder non-responder erfolgte anhand der DAS28-Veränderungen. Die 10 Seren von respondern und non-respondern zum Zeitpunkt V0 und V6 wurden je Gruppe gepoolt und mit Hilfe einer HPLC- basierten Immunodepletion zur Entfernung hochmolekularer Proteine vorbereitet. Nach Konzentrierung der Proben erfolgte mittels differentieller 2D Gel- Elektrophorese (DIGE) die Auftrennung der Serumproteine nach ihrem isoelektrischen Punkt und nach ihrer molekularen Masse im 2D-Gel. Anschließend wurden Proteinspots massenspektrometrisch analysiert und identifiziert. Die Proteinprofile der beiden Gruppen wurden mit Hilfe der Delta 2D Software analysiert und quantifiziert. Die Verifizierung der Ergebnisse erfolgte mit 1-und 2D Western- Blots (WB) sowie mit Glykoproteinfärbungen im 2D-Gel. Die zunächst explorative differentielle 2D Gel- Elektrophorese und Massenspektrometrie ergaben signifikante Unterschiede in den Proteinprofilen bei respondern und non-respondern in V0 und V6. Insbesondere Akutphaseproteine und deren Fragmente fanden sich vor Einleitung der Etanercept Therapie vermehrt exprimiert bei respondern. Darüber hinaus waren Proteine wie a1-Antitrypsin, Haptoglobin (Hp) und Vitamin-D-binding Protein (DBP) in den responder- Seren zum Zeitpunkt V6 vermehrt vorhanden. Im 1D-Western-Blot (WB) bestätigte sich eine vermehrte Hp-Regulation bei den respondern und eine Zunahme bis V6. Der 2D-WB zeigte eine Zunahme des DBP bis Woche 24. Außerdem war das DBP der responder weniger stark glykosyliert als das der non-responder. Es zeigte sich zudem, dass der Hp2-1 Phänotyp bei den non-respondern häufiger vorlag. Durch die Anwendung der klinischen Proteomanalytik in immundepletierten Seren lassen sich potentielle Biomarker für die Vorhersage des Ansprechens auf eine TNF-α Antagonisten Therapie identifizieren. Zu Verifizierung der Hp-Regulation erfolgt nach Abschluss dieser Arbeit eine Untersuchung der gesamten Studienkohorte mittels ELISA.