Analyse des PEX1-Gens bei Patienten mit Zellweger-Syndrom: Identifikation einer neuen Deletion und Untersuchung von Polymorphismen in der 5'-untranslatierten Region
Analysis of the PEX1 gene of patients with Zellweger syndrome: Identification of a novel deletion and characterization of polymorphisms in the 5' untranslated region
by Jana Rabenau
Date of Examination:2011-07-19
Date of issue:2011-07-14
Advisor:Prof. Dr. Jutta Gärtner
Referee:Prof. Dr. Jutta Gärtner
Referee:Prof. Dr. Iris Bartels
Referee:Prof. Dr. Martin Oppermann
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Zellweger spectrum disorders are autosomal recessive peroxisomal metabolic diseases. Mutations in the PEX1 gene are the most common cause. This thesis deals with the analysis of the PEX1 gene and characterization of two polymorphisms in the 5 UTR of PEX1 deficient patients. Major focus is the identification of the molecular cause for peroxisome biogenesis disorder in two patients (ZS 8, ZS 26). Only one heterozygous PEX1 mutation, c.2528 G>A (p.Gly843Asp), was identified in both patients. The wildtype mRNS of patient ZS 26, determined by allelespecific quantitative real time-PCR, was significantly underrepresented. A novel pathogenic mutation was identified in patient ZS 26 by applying long range PCR based deletion screening. We identified a 3838 bp deletion spanning exons 10 to 12 of the PEX1 gene. The deleted area contained an insertion of 395 bp, a duplicated sequence from intron (16 g.20805_24642delins28829_29223; NCBI Reference Sequence NC_000007.13). The deletion was inherited from the healthy father. Based on reporter assays described in literature, the 5 polymorphism c.-137 T>C of the PEX1 gene leads to reduced PEX1 expression, whereas the 5 polymorphism c.-53 C>G of the PEX1 gene leads to increased expression. If present together, these polymorphisms cause near-normal PEX1 expression. Within 30 PEX1-deficient patients four combinations of 5 polymorphisms could be found in this work: c.-137 TT/c.-53 CC (43 %), c.-137 TC/c.-53 CG (37 %), c.-137 CC/c.-53 GG (10 %) und c.-137 TC/c.-53 CC (10 %). The 5 polymorphism c.-53 C>G has occurred on a c.-137 T>C background, as the latter is found independently of the c.-53 C>G change. The common c.2528G>A (p.Gly843Asp) mutation appears to be independent of a specific upstream polymorphism in contrast to the second most common mutation, c.2097_2098insT (p.Ile700TyrfsX42), that arose on the basis of the c.-137 T>C c.-53 C>G polymorphic constellation. Our results indicate that the exonic PEX1 mutation correlates with patient survival, while the two 5 polymorphisms analysed in this study do not seem to be of diagnostic and/or prognostic value. Both 5 polymorphisms have been described as 5 UTR polymorphisms. The PEX1 5 UTR was reported to extend up to c.-245. To experimentally confirm the transcriptional start point of PEX1, we conducted a 5 RACE. The longest 5 extension of cDNA that could be identified by this approach extended to c.-120. Our study suggests that only the PEX1 5 polymorphic site at c.-53 is part of the 5 UTR while the polymorphism 137 bp upstream of the PEX1 start codon might be part of the PEX1 promoter.
Keywords: peroxisome; Zellweger syndrome; peroxisome biogenesis disorder; PEX1; 5 UTR polymorphisms; SNP
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Erkrankungen des Zellweger-Spektrums sind autosomal rezessiv vererbte peroxisomale Stoffwechselerkrankungen. Mutationen im PEX1-Gen sind die häufigste Ursache. In dieser Arbeit wurden bei PEX1-defizienten Patienten das PEX1-Gen analysiert und zwei Polymorphismen in der 5 UTR charakterisiert. Zentraler Gegenstand der Arbeit war die Klärung der molekularen Ursache der Peroxisomenbiogenesestörung bei zwei Patienten (ZS 8, ZS 26). Im Vorfeld wurde bei beiden Patienten jeweils nur eine heterozygote Mutation im PEX1-Gen, c.2528 G>A (p.Gly843Asp), detektiert. Bei Patient ZS 26 wurde über eine allelspezifische real-time-PCR eine deutlich unterrepräsentierte Wildtyp-mRNS festgestellt. Mittels einer in dieser Arbeit etablierten long-range-PCR konnte im PEX1-Gen von Patient ZS 26 eine zweite pathogene Mutation entdeckt werden - eine Deletion von Exon 10, 11 und 12 mit einer Länge von 3838 bp. Die deletierte Region enthielt eine Insertion von 395 bp, bei der es sich um eine Duplikation von Intron 16 handelte (g.20805_24642delins28829_29223; NCBI Reference Sequence NC_000007.13). Die Deletion wurde vom gesunden Vater vererbt. In der Literatur ist eine Reportergenuntersuchung beschrieben, bei der der 5 -Polymorphismus c.-137 T>C zu einer reduzierten PEX1-Genexpression führt, während der 5 -Polymorphismus c.-53 C>G die PEX1-Genexpression erhöht. Bei gleichzeitigem Auftreten beider Polymorphismen wurde eine annähernd normale PEX1-Genexpression festgestellt. Bei 30 PEX1-defizienten Patienten traten in unseren Untersuchungen vier Konstellationen auf: c.-137 TT/c.-53 CC (43 %), c.-137 TC/c.-53 CG (37 %), c.-137 CC/c.-53 GG (10 %) und c.-137 TC/c.-53 CC (10 %). Der 5 -Polymorphismus an Position c.-53 ist offenbar auf dem allelischen Hintergrund des 5 -Polymorphismus an Position c.-137 entstanden, welcher auch unabhängig von dem 5'-Polymorphismus c.-53 C>G gefunden wurde. Im Gegensatz zu der häufigen Mutation, c.2528G>A (p.Gly843Asp), ist die zweithäufigste Mutation, c.2097_2098insT (p.Ile700TyrfsX42) auf dem allelischen Hintergrund der 5 -Polymorphismen entstanden. Die Ergebnisse zeigen, dass die exonischen Mutationen im PEX1-Gen mit dem Überleben der Patienten korrelieren, während die zwei in dieser Arbeit analysierten 5 -Polymorphismen nicht für diagnostische und/oder prognostische Zwecke in Betracht gezogen werden können. Beide 5 -Polymorphismen gehören nach Literaturangaben zur 5 UTR mit einem Transkriptionsstartpunkt an Position c.-245. In dieser Arbeit wurden mit einer 5 -RACE-PCR Klone detektiert, die an Position c.-120 den PEX1-mRNS-Beginn anzeigten. Aufgrund dieser Ergebnisse gehen wir davon aus, dass nur der PEX1-5 -Polymorphismus an Position c.-53 Teil der 5 UTR ist, während der 5 -Polymorphismus 137 bp stromaufwärts des Translationsstartpunktes Teil des PEX1-Promoters ist.
Schlagwörter: Peroxisomen; Zellweger-Syndrom; Peroxisomenbiogenesedefekt; PEX1; 5 UTR-Polymorphismen; SNP